抑制RANKL诱导破骨细胞分化的DNA适配子的筛选

目的:筛选能高特异性、高亲和力结合RANKL蛋白并有效抑制RANKL对破骨细胞诱导分化作用的DNA适配子。方法:首先,采用原核系统表达并纯化RANKL蛋白,通过SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential)技术从人工合成的单链随机寡核苷酸文库中筛选能高特异性、高亲和力结合RANKL蛋白的DNA适配子。然后,用RNAfolding sever software分析适配子空间结构,以ELISA检测DNA适配子和RANKL亲和力大小并筛选出亲和力最高的一组DNA适配子用以验证DNA适配子对RANKL诱导破骨细胞分化的抑制作用。结果:(1)成功在原核系统表达并纯化RANKL蛋白;(2)筛选出能高特异性、高亲和力结合RANKL蛋白的12个DNA适配子。(3)与对照组相比,不同浓度DNA适配子能明显抑制TRAP阳性破骨细胞数量(P0.05),且浓度越高抑制效果越明显。结论:成功筛选出的DNA适配子能特异性结合RANKL蛋白并有效抑制RANKL对破骨细胞的诱导分化功能。     

AMPK调控内质网应激抵抗COPD大鼠肺泡上皮细胞凋亡的实验研究

目的:初步探讨AMPK在内质网应激所致COPD大鼠肺泡上皮细胞凋亡中所起的作用及机制。方法:实验分三组:对照组,COPD模型组,AICAR干预组,以香烟烟雾烟熏加气管内滴注脂多糖方法构建COPD大鼠模型,取大鼠肺组织行HE染色病理观察,免疫组化,western blot检测p-AMPK/AMPK,ORP150,caspase-3及CHOP表达,TUNEL法检测各组凋亡情况。结果:病理HE染色提示模型组大量炎症细胞浸润,肺大疱形成,支气管壁发生狭窄;AICAR干预组炎症细胞较模型组减少。与正常对照组相比,免疫组化及western blot均提示模型组中p-AMPK和ORP150蛋白表达含量增强,差异有统计学意义(P0.05)。而AICAR干预组中p-AMPK/AMPK及ORP150蛋白表达较模型组明显上升,差异有统计学意义(P0.05)。内质网应激相关凋亡指标CHOP及caspase-3的表达在模型组明显增强,较正常组比较差异有显著性(P0.05),而AICAR组中凋亡指标较模型组明显下调。结论:AMPK可以保护肺泡上皮细胞免于香烟烟雾所致内质网应激凋亡,且有可能通过增加ORP150来实现其保护作用。     

全反式维甲酸对乙酰胆碱受体特异性淋巴细胞的免疫调控作用

目的:观察全反式维甲酸(ATRA)对乙酰胆碱受体(AChR)特异性淋巴细胞的体外调控作用,探讨其治疗重症肌无力(MG)的可能机制。方法:建立完全弗氏佐剂(CFA)对照组及实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)组大鼠,并获取淋巴结单个细胞悬液,以ACh R97-116多肽片段以及不同浓度的ATRA体外培养72 h,采用流式细胞仪法、CCK-8法、ELISA法分别检测活细胞比例、细胞凋亡和周期的改变以及Th亚群的格局和B细胞抗体分泌能力的变化。结果:ATRA显著降低活细胞比例(P0.001);不同浓度的ATRA均促进了特异性细胞群的凋亡(P0.001),且呈剂量依赖性,而ATRA未改变AChR特异性淋巴细胞的生长周期;ATRA处理后,CFA和EAMG组的淋巴细胞增殖均受到明显抑制,且ATRA对ACh R特异性的淋巴细胞的抑制明显(EAMG组,P0.01)于CFA组(P0.05);ATRA干预后,ACh R特异性CD4+T淋巴细胞的比例下降(P0.01),且ATRA促进了Th2、Treg细胞亚群百分比(P_(IL-4)0.001,P_(Foxp3)0.001),而抑制了促炎性的Th17、Th1细胞亚群百分比(P_(IL-17)0.05,P_(IFN-γ)0.001);ATRA能够降低ACh R特异性B细胞的抗体分泌能力(P0.01)。结论:ATRA不仅能抑制ACh R特异性T细胞功能,同时也能抑制ACh R特异性B细胞功能,其在MG的临床治疗中可能起治疗作用。     

靶向于TNF-α和RANKL的人源化抗体对DBA/1小鼠单关节炎的保护作用

目的制备同时拮抗肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和核因子κB受体活化因子配体(re-ceptor activator of NF-κB ligand,RANKL)的人源化单克隆抗体(h8G12),通过单关节炎小鼠模型,评估h8G12在抑制TNF-α引起的炎症反应和拮抗RANKL引起的骨破坏中的保护作用。方法培养稳定表达h8G12的CHO细胞株,观察细胞生长状态,用间接ELISA检测细胞培养上清中h8G12的表达水平。纯化的h8G12经SDS-PAGE、West-ern blot分析及鉴定,用间接ELISA观察其亲和力。通过向DBA/1小鼠膝关节腔注射人TNF-α重组蛋白和人RANKL重组蛋白,建立单关节炎小鼠模型。用组织学评估观察不同给药方案[阴性对照组、阳性对照组、阿达木单抗(adalimumab,ADA)组和h8G12组]对小鼠单关节炎引起的炎症浸润、软骨侵蚀、膝关节腔内破骨细胞分化的保护作用。结果 CHO细胞株培养96 h时细胞生长状态良好,可稳定分泌h8G12;纯化的h8G12纯度可达90%,Western blot可见特异性条带,且可与rh TNF-α和rh RANKL结合。在单关节炎小鼠模型中,苏木精-伊红染色显示,h8G12组关节腔、周围软组织及骨髓腔内炎性细胞浸润明显少于阳性对照组,炎症评分降低了50%,治疗效果与ADA相似。甲苯胺蓝染色显示,h8G12组病理评分出现显著下降,h8G12治疗后小鼠关节结构相对完好,关节软骨厚度接近正常水平。抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示,h8G12组关节腔内破骨细胞明显减少。结论 h8G12可有效抑制TNF-α引起的炎症反应和拮抗RANKL引起的骨破坏,为类风湿关节炎的治疗提供了新方法。     

旋转磁场治疗印^60CO辐射造血损伤小鼠生存分析的实验研究

目的：初步探讨旋转恒定磁场治疗急性骨髓型放射病的效果。方法：BALB／C小鼠按体重随机分为磁疗组和对照组，每组再各分为4组．分别接受0Gy、6．0Gy、8．0Gy、10．0Gy ^60COγ射线全身辐射，照后，对照组不作任何处理，磁疗组接受磁场处理30d，每天2次，每次1．5h，旋转磁场强度为0．6T，比较两组小鼠30d的存活率和存活期。结果：单纯磁场处理对正常小鼠生存状态及存活率无明显影响；10．0Gy组和8．0Gy组小鼠生存率磁疗组与对照组之间比较均无统计学差异（P〉0．05）；6．0Gy组生存率磁疗组和对照组之间比较有统计学差异（P〈0．05），其磁疗组30d平均存活率为71．43％，平均存活期为（24．93±8．43）d，对照组30d平均存活率21．4l％．平均存活期为（17．07±7．70）d。结论：旋转恒定磁场不能提高10．0Gy及8．0Gy剂量所致极重度急性骨髓型放射病小鼠的生存率，但对6．0Gy所致重度急性骨髓型放射病有明显的保护作用，从而为旋转恒定磁场应用于临床治疗重度急性骨髓型放射损伤提供了实验依据。     

基质金属蛋白酶组织抑制剂的生物学功能

ＴＩＭＰｓ是一组多功能因子家族，能特异的抑制ＭＭＰｓ的活性。生理条件下产生的ＴＩＭＰｓ对正常ＥＣＭ的改建和组织器官的生理功能的维持具有重要作用。在病理条件下，作为ＭＭＰｓ的抑制剂则抑制肿瘤的侵袭和转移，启动和加重肝纤维化；同时不依赖其ＭＭＰｓ抑制活性对细胞生长，增殖和分化发挥重要作用，而作为ＶＥＧＦ生成的刺激因子则促进肿瘤的生长和转移。提示通过调节其基因表达和活性，在人类相关疾病的治疗中将会有更广     

P277多肽融合热休克蛋白65提高抗1型糖尿病的作用

为了提高P277肽抗1型糖尿病的作用, 把P277肽融合在卡介苗热休克蛋白65的C端, 构建了pET28a- HSP65-P277高效表达载体, 在大肠杆菌中高效可溶性表达。利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析分离纯化了融合蛋白HSP65-P277。使用HSP65-P277在没有任何佐剂存在的情况下免疫非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠, 通过三次腹腔注射, 每月收集被免疫动物的血清, 血糖浓度用自动生化分析仪测定。结果显示HSP65-P277免疫组小鼠血糖平均值及糖尿病的累积发病率和其余组相比均有显著差异(P<0.01), 融合蛋白HSP65-P277抗NOD小鼠糖尿病的作用显著高于单独的P277和HSP65。为进一步开发能用于临床的1型糖尿病疫苗提供了良好的设计思路, HSP65-P277极有可能进一步发展成为新的抗I型糖尿病的疫苗。