乙型肝炎表面抗原S—蛋白糖化位点序列的人工变异及其哺乳动物细胞表…

利用末端重叠ＰＣＲ法和定点突变技术，获得了去除Ｎ－连接多糖结构的乙肝表面抗原Ｓ突变基因，将乙肝表面抗原Ｓ－蛋白中结合Ｎ－连多糖结构序列Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ中的第１４８苏氨酸的密码子ＡＣＴ，改变为编码甘氨酸的密码子ＧＧＴ。构建了该突变基因的表达载体并在ＣＨＯ细胞中表达，筛选到两株表达水平较高的细胞系。对其中的一株细胞系Ｃ４１的表达产物做了初步纯化和鉴定，纯化样品经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析，只含有２３ｋ     

中老缅边境蚊虫标本中Nam Dinh病毒的分离和鉴定

2012年在云南省南部中老缅边境地区采集的库蚊中分离到3株病毒(YN12039、YN12040、YN12060),该病毒只引起C6/36细胞发生病变。负染电镜观察病毒颗粒呈球形,直径60~80nm,有囊膜,表面有刺突。采用RTPCR方法对分离株的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA-polymerase,RdRp)、HEL1(superfamily 1helicase)、S蛋白(spike protein)基因进行扩增,同源性分析显示3株云南新分离株与Nam Dinh病毒(NDiV)RdRp、HEL1、S蛋白氨基酸序列相似度最高,均为98%以上。系统进化分析结果表明,3株云南新分离株与NDiV的亲缘关系最近,处于同一进化分支。该研究结果丰富了NDiV病毒的信息,对NDiV病毒分子特征、分布区域和物种嗜性等特征提供了数据参考。     

黑籽南瓜NBS类基因CfRFN2的克隆及VIGS验证

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)是云南特有的具有高抗枯萎病遗传性状的瓜类种质资源。为鉴定黑籽南瓜中NBS-LRR类基因的抗病功能,该研究从其叶片中克隆了NBS类基因CfRFN2 (GenBank ID:MK618462),测序全长为4 303 bp,完整的编码框长度为4 092 bp,编码1 363个氨基酸残基,该基因注释为拟南芥抗病蛋白At4g27190类转录体X1的同源基因,含有1个NB-ARC和2个LRR结构域,属于具有信号肽的可溶性蛋白。核苷酸相似性分析显示,CfRFN2与其他瓜类NBS类基因相似性在87%～98%之间;系统进化树分析表明,CfRFN2蛋白和瓜类的其他NBS类抗病蛋白聚为一个分支,其中CfRFN2蛋白与中国南瓜和美洲南瓜的RPS2、印度南瓜的RPS2-like亲缘关系最近,其次是黄瓜的At4g27190和苦瓜的At4g27220,与甜瓜的Atg27190亲缘关系相对较远;组织表达特性分析表明,CfRFN2基因在黑籽南瓜叶片中表达量最高,其次是茎,而在果皮和根中表达量较低。该研究采用烟草脆裂病毒载体系统,构建了黑籽南瓜VIGS沉默载体pTRV2-CfRFN2,含沉默载体的农杆菌侵染黑籽南瓜幼苗后接种枯萎病菌,qRT-PCR检测表明,接种后2 d和4 d的转pTRV2-CfRFN2沉默组植株的CfRFN2基因表达量比接种后同时期的野生型植株显著降低(分别下降34.75%和98.27%),病情指数增加为野生型的1.32倍,初步证明黑籽南瓜CfRFN2基因具有抗枯萎病的功能,推测该基因可能在黑籽南瓜抗枯萎病防御过程中发挥着重要作用。该研究中NBS类基因CfRFN2的克隆和VIGS验证为黑籽南瓜更多优异基因的克隆和功能验证奠定了前期基础,也为发掘黑籽南瓜优异抗病基因和开展瓜类分子育种提供新信息。     

环氧树脂固定化的Bacillus sp.DL-2胞外蛋白酶在拆分(±)-乙酸苏合香酯中的应用

环氧基是一个非常活跃的基团,它能与酶、蛋白质和核酸等生物分子发生反应形成共价键,有利于生物分子的固定化。经共价结合法固定化的酶其稳定性及重复使用性可得到显著提高。用环氧树脂ES-103B为载体采用共价结合法对海洋细菌Bacillus sp. DL-2的胞外蛋白酶进行固定化,经过单因素实验优化条件得出最优固定化条件为:p H 8. 0的胞外蛋白酶溶液,25 g/L的ES-103B,45℃下反应8h。采用此最优条件下的固定化酶拆分(±)-乙酸苏合香酯制备出了e. e. p=97. 5%的(R)-1-苯乙醇(产率为45. 0%)和e. e. s=99. 2%的(S)-乙酸苏合香酯(产率为83. 9%)。该固定化酶拆分(±)-乙酸苏合香酯在重复使用8次后制备出的(R)-1-苯乙醇的e. e. p仍大于90%,且固定化胞外蛋白酶在4℃下具有较好的储存稳定性。