青鳉prdm14的原核表达、多克隆抗体制备及其应用

青鳉(Oryzias latipes)是研究遗传发育和细胞多能性的重要模式鱼类, 为探究prdm14同源基因的潜在作用, 实验将青鳉prmd14经原核表达后制备了兔抗Prdm14多克隆抗体。首先, 将prdm14基因的部分编码区连接到pET32a质粒中, 构建重组表达载体pET32a-prdm14?600。随后将重组载体转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3), 经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)诱导表达, 获得分子量为60 kD的Prdm14重组蛋白。接着大量诱导蛋白表达并切胶纯化, 免疫家兔(Oryctolagus cuniculus), 6周后获得阳性抗体, 最后通过ELISA和Western blot检测抗体效价及其特异性。结果显示, 在37℃、0.6 mmol/L IPTG、诱导3h的条件下, 可获得Prdm14重组蛋白的高效表达; 制备的兔抗青鳉Prdm14多克隆抗体能够特异性识别青鳉组织中表达的Prdm14蛋白以及在HepG2细胞中过表达的青鳉Prdm14: EGFP融合蛋白。综上所述, 研究首次制备了一种能有效识别青鳉Prdm14的多克隆抗体, 该抗体的获得为后续研究prdm14基因在鱼类多能性干细胞中的作用提供了有力工具。     

重组中华仓鼠卵巢细胞培养过程控制的研究进展

中华仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cells,CHO)是科研及生产中用于蛋白表达的常用体系。与大肠杆菌相比,CHO获得高表达的细胞株所需时间更长,蛋白产量更低。因此,大规模培养细胞所需的成本较高,培养条件也不易掌握。但该体系产生的蛋白纯度高,因而被广泛用于工业生产中。本文对CHO细胞的培养方式、pH值测定、渗透压、溶氧及培养液成分的选择等多方面条件进行综述,为优化中华仓鼠卵巢细胞培养的策略及具体方法提供理论依据。     

草鱼TRIM32基因克隆表达及功能研究

TRIM (Tripartite-motif protein) 家族是机体先天性免疫的重要成员, 参与细胞增殖分化、细胞凋亡、肿瘤抑制、抗病毒等过程。为了进一步探究TRIM蛋白在鱼类免疫中的作用, 实验利用PCR方法克隆了草鱼TRIM32基因的编码区全长, 共1980 bp, 编码660个氨基酸。草鱼TRIM32具有TRIM家族典型的3个结构域, 与斑马鱼TRIM32的核苷酸序列同源性较高, 遗传进化分析也聚为一支。间接免疫荧光、Western-blotting检测结果显示草鱼TRIM32在EPC细胞中成功表达, 主要以点状分布在细胞质中, 细胞核中表达量较少; 组织分布分析表明TRIM32在被检测的11个组织中均有表达, 其中在头肾组织中的表达量明显高于其他组织; 不同胚胎发育时期的表达分析进一步表明, TRIM32在受精卵时期、卵裂期和囊胚期的表达量显著高于其他时期(P<0.05), 随后表达量下降, 直到出膜后表达量再次显著性升高。此外, 双荧光素酶检测系统显示TRIM32能够激活NF-κB信号通路, 诱导下游的炎症反应。结果显示, 草鱼TRIM32广泛分布于鱼体内, 并参与机体的天然免疫反应, 对于抵抗病原体的入侵具有重要作用。     

萘对川西亚高山森林土壤微生物量、丰度和磷脂脂肪酸的影响

萘作为土壤动物化学抑制剂已在土壤动物生态功能的研究中广泛使用,但其非目标效应使其应用仍存在很大的不确定性。为了解在亚高山森林土壤应用萘抑制土壤动物群落的非目标效应,以川西亚高山森林土壤为研究对象,采用微缩实验研究了土壤微生物生物量、丰度和磷脂脂肪酸对萘胁迫的短期响应。结果表明,萘处理和对照的土壤微生物生物量碳(MBC)、真菌丰度以及细菌、真菌、革兰氏阳性菌(G~+)和革兰氏阴性菌(G~-)PLFAs含量在整个培养期间表现为降低的变化趋势,二者的土壤微生物生物量碳和G~+PLFAs含量以培养52d最低,细菌、真菌和G~-PLFAs含量以培养的45d最低。萘处理和对照的微生物生物量氮(MBN)含量表现出先升高后降低的动态,微生物生物量碳氮比(MBC/MBN)则表现为相反趋势。对照的真菌/细菌PLFAs比值呈现先升高后降低的动态,以培养的17d最高,但萘处理的真菌/细菌PLFAs比值无明显变化规律;萘处理的G~+/G~-PLFAs比值表现为降低的变化趋势,对照的G~+/G~-PLFAs比值表现为先降低后升高的趋势。萘处理仅显著影响了G~+/G~-PLFAs比值,但萘处理和采样时间的交互作用显著影响MBC/MBN、细菌丰度、真菌/细菌丰度比以及细菌、真菌的PLFAs含量、真菌/细菌PLFAs比值、G~+/G~-PLFAs比值。萘作为土壤动物抑制剂对川西亚高山森林土壤微生物群落的非目标效应具有时间变异性。     

人睫状神经营养因子的原核表达,纯化及其生物效应

人睫状神经营养因子（ｈＣＮＴＦ）克隆入ｐＢＶ２２０中，在ＤＨ５α菌株中表达，重组蛋白以包含体的形式存在，表达量为菌体总蛋白的５０％左右。经比较发现用２ｍｏｌ／Ｌ脲洗涤包含体可溶解大量可溶性细菌蛋白，且包含体损失较小。在高浓度变性剂条件下进行ｓｅｐｈａｒｃｙｌＳ－２００凝胶过滤，解决了纯化中ｈＣＮＴＦ易聚合的问题，在低浓度变性剂条件下进行ＤＥＡＥ离子交换，有利于蛋白活性的保持。经两步纯化后得到均一性ｈＣＮＴＦ，纯度达９５％以上。在自然状态下使ｈＣＮＴＦ复性。纯化复性后的ｈＣＮＴＦ对无血清培养的鸡胚背根节神经元和脊髓腹角运动神经元有明显的维持存活和促进生长发育的生物效应。     

日本沼虾两种抗脂多糖因子的特性研究

为了研究抗脂多糖因子ALFs在日本沼虾先天性免疫中的功能作用, 研究从日本沼虾中克隆了2种抗脂多糖因子MnALF1、MnALF2。MnALF1 cDNA 全长1008 bp, 编码121个氨基酸; MnALF2 cDNA 全长836 bp, 编码124个氨基酸。这2种氨基酸均包含有一个信号肽序列和一个LPS结合位点, 并且在结合位点的两端(N-端和C-端)都有2个保守的半胱氨酸残基。这2种MnALFs与之前发现的甲壳动物的ALFs是非常相似的。qRT-PCR结果显示MnALFs在所有被检测的组织中均有表达。其中MnALF1主要在心脏和小肠内表达, 而MnALF2则主要在血细胞和肝胰脏中表达。在用嗜水气单胞菌刺激之后发现2种MnALFs在心脏、小肠、血细胞、肝胰脏中都呈现出明显的时间依赖表达模式(MnALF1在刺激之后呈现出先减少后增加的趋势, 之后分别在不同组织的不同时间点达到最大值; 然而, 对于MnALF2, 在心脏和小肠中先减少后增加, 在血细胞和肝胰脏中呈现出先增加后减少, 最后都在24h达到最大值)。结果提示这2种MnALF具有不同的组织特异性, 并且在细菌侵染的免疫防御中起着重要的保护作用。     

食物变化量对艾虎取食行为的影响

在室内条件下，通过双通道选择实验比较艾虎在不同饥饿条件下对固定食物量斑块和变化食物量斑块的利用程度，确定艾虎对食物变化量的敏感性，以验证风险敏感取食原理。研究结果表明，训练期实验中，艾虎对固定食物量斑块中的取食量和利用频次明显高于变化食物量斑块，而对两个斑块的利用时间基本相同；艾虎饥饿一天后对固定食物量斑块中的利用频次明显高于变化食物量斑块，而对两个斑块的利用时间和取食量基本相同；艾虎饥饿两天后对两个斑块利用程度与训练期的结果相同；同时，艾虎在两个斑块中的取食量均与饥饿程度无关，而对两个斑块的利用时间和利用频次均随饥饿程度明显降低。因此，艾虎对固定食物量斑块和变化食物量斑块的利用程度基本相同，食物变化量对艾虎的取食行为没有明显影响，艾虎对食物变化量是不敏感的。产生这种结果的主要原因可能是艾虎的能量代谢水平较低，在食物受到限制时主要采用降低活动使单位活动时间内所获得的能量值达到最大的取食对策增加自身的存活机率。     

牛病毒性腹泻病毒E^rns-E2融合蛋白在果蝇S2细胞中的表达与鉴定

目的：利用果蝇S2细胞表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）Erns-E2融合蛋白,并对其抗体结合能力进行鉴定。方法：用RT-PCR方法扩增BVDV NADL株Erns和E2蛋白的编码基因,利用（G4-S）3柔性15肽基因将扩增的2个基因连接,再与昆虫表达载体pMT/BiP/V5-His连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5-His-Erns-E2,将后者与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞后表达Erns-E2融合蛋白,并对表达产物进行鉴定。结果：SDS-PAGE结果表明,融合蛋白相对分子质量为76800;Western blotting检测表明,该融合蛋白具有与BVDV抗体良好的结合能力。结论：BVDV的Erns-E2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行表达;经鉴定,表达产物具有良好的抗体结合能力,可用于抗原检测。