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1.
2.
相邻的反向重复DNA片段有形成单链内二级结构的倾向,属于一种测序困难的DNA模板。解决RNAi载体插入的反向重复片段的测序问题,为该类载体正确性的测序验证奠定基础。采用常规分子克隆方法构建表达小麦TaATG2串联反向重复片段的RNAi载体,设计2种策略对经菌落PCR初步鉴定的载体进行测序验证:一种是以完整的载体质粒为模板进行测序;另一种是先对载体进行酶切处理,切除反向重复片段中的一个后对保留另一个片段的线性载体进行测序。结果表明,第一种测序策略受到串联反向重复片段形成的单链内部二级结构的影响,测序信号在反向重复片段处出现衰减或乱峰,无法读取序列。第二种测序策略排除了2个反向重复片段之间的干扰,保留在载体上的片段测序信号清晰,序列准确。采用酶切切除一个片段后进行测序的方法,经过2次酶切和2次测序可以有效地对载体上的2个反向重复片段分别进行序列测定,进而确认构建载体的正确性。 相似文献
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4.
人睫状神经营养因子的原核表达,纯化及其生物效应 总被引:2,自引:0,他引:2
人睫状神经营养因子(hCNTF)克隆入pBV220中,在DH5α菌株中表达,重组蛋白以包含体的形式存在,表达量为菌体总蛋白的50%左右。经比较发现用2mol/L脲洗涤包含体可溶解大量可溶性细菌蛋白,且包含体损失较小。在高浓度变性剂条件下进行sepharcylS-200凝胶过滤,解决了纯化中hCNTF易聚合的问题,在低浓度变性剂条件下进行DEAE离子交换,有利于蛋白活性的保持。经两步纯化后得到均一性hCNTF,纯度达95%以上。在自然状态下使hCNTF复性。纯化复性后的hCNTF对无血清培养的鸡胚背根节神经元和脊髓腹角运动神经元有明显的维持存活和促进生长发育的生物效应。 相似文献
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7.
冯忠令 《国外医学:分子生物学分册》2000,22(4):240-243
基因治疗可能是预防神经元变性的最有用的方法。腺病毒载体、腺相关病毒载体及逆转录病毒载体等,作为将神经营养因子基因转移珐以非神经元细胞为靶细胞的主要方法,具有潜在的区域特异性、持续性、而受性的特点,并能稳定表达神经营养因子蛋白,右逆转衰老等多种因素导致的胆碱能神经元变性,引起功能的恢复。 相似文献
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9.
具有重要应用价值的真核表达系统 总被引:4,自引:1,他引:3
基于T7RNA聚合酶与T7强启动子(Φ10)间的特异认识而建立起来的偶联表达系统在大肠杆菌中已取得了令人满意的结果。最后,该系统在酵母、昆虫、浦乳动物细胞和植物细胞中陆续实现了高效表达。T7NRA聚合酶-Φ10启动子偶联表达系统的相对独立性和高效性,不仅预示着该系统可以在真核基因工程中发挥重要作用,而且其独特的作用机制为人们探索新的特异高效真核表达系统提供了一个可供借鉴的模式。 相似文献
10.
为研究鸭C4结合蛋白(C4b-binding protein,C4BP)与鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)的相互作用,对鸭C4BPα进行克隆、原核表达,免疫小鼠制备多克隆抗体,并利用间接免疫荧光试验及斑点杂交试验验证C4BP与RA的相互作用。结果显示,鸭C4BPα核苷酸序列全长为1230bp,与鸡C4BPα的相似性最高(82.1%);系统进化树分析发现,鸭C4BPα与鸡C4BPα处于同一系统进化树分支上,两者遗传进化关系最近;C4BPα在大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)中能高效表达,重组蛋白以胞内可溶性形式存在;多克隆抗体效价超过1∶10000,并且可以与重组蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验和斑点杂交试验结果显示RA与鸭C4BP可以发生相互作用。研究结果为进一步揭示RA的致病机制奠定了基础。 相似文献