DNA标记技术在螨类系统学研究中的应用

长期以来,螨类主要依靠其形态特征进行系统学研究。DNA标记是指能反映生物个体或物种间基因组中某种差异特征的DNA片段。近年来,DNA标记技术在螨类系统学研究中得到越来越广泛的应用。本文综述了随机扩增多态性RAPD、限制性内切酶片段长度多态性RFLP、微卫星SSR、核酸序列扩增、扩增片段长度多态性AFLP和直接扩增片段长度多态性DALP等6种DNA标记技术在螨类系统学研究中的应用现状及前景。     

抑制RANKL诱导破骨细胞分化的DNA适配子的筛选

目的:筛选能高特异性、高亲和力结合RANKL蛋白并有效抑制RANKL对破骨细胞诱导分化作用的DNA适配子。方法:首先,采用原核系统表达并纯化RANKL蛋白,通过SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential)技术从人工合成的单链随机寡核苷酸文库中筛选能高特异性、高亲和力结合RANKL蛋白的DNA适配子。然后,用RNAfolding sever software分析适配子空间结构,以ELISA检测DNA适配子和RANKL亲和力大小并筛选出亲和力最高的一组DNA适配子用以验证DNA适配子对RANKL诱导破骨细胞分化的抑制作用。结果:(1)成功在原核系统表达并纯化RANKL蛋白;(2)筛选出能高特异性、高亲和力结合RANKL蛋白的12个DNA适配子。(3)与对照组相比,不同浓度DNA适配子能明显抑制TRAP阳性破骨细胞数量(P0.05),且浓度越高抑制效果越明显。结论:成功筛选出的DNA适配子能特异性结合RANKL蛋白并有效抑制RANKL对破骨细胞的诱导分化功能。     

靶向于TNF-α和RANKL的人源化抗体对DBA/1小鼠单关节炎的保护作用

目的制备同时拮抗肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和核因子κB受体活化因子配体(re-ceptor activator of NF-κB ligand,RANKL)的人源化单克隆抗体(h8G12),通过单关节炎小鼠模型,评估h8G12在抑制TNF-α引起的炎症反应和拮抗RANKL引起的骨破坏中的保护作用。方法培养稳定表达h8G12的CHO细胞株,观察细胞生长状态,用间接ELISA检测细胞培养上清中h8G12的表达水平。纯化的h8G12经SDS-PAGE、West-ern blot分析及鉴定,用间接ELISA观察其亲和力。通过向DBA/1小鼠膝关节腔注射人TNF-α重组蛋白和人RANKL重组蛋白,建立单关节炎小鼠模型。用组织学评估观察不同给药方案[阴性对照组、阳性对照组、阿达木单抗(adalimumab,ADA)组和h8G12组]对小鼠单关节炎引起的炎症浸润、软骨侵蚀、膝关节腔内破骨细胞分化的保护作用。结果 CHO细胞株培养96 h时细胞生长状态良好,可稳定分泌h8G12;纯化的h8G12纯度可达90%,Western blot可见特异性条带,且可与rh TNF-α和rh RANKL结合。在单关节炎小鼠模型中,苏木精-伊红染色显示,h8G12组关节腔、周围软组织及骨髓腔内炎性细胞浸润明显少于阳性对照组,炎症评分降低了50%,治疗效果与ADA相似。甲苯胺蓝染色显示,h8G12组病理评分出现显著下降,h8G12治疗后小鼠关节结构相对完好,关节软骨厚度接近正常水平。抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示,h8G12组关节腔内破骨细胞明显减少。结论 h8G12可有效抑制TNF-α引起的炎症反应和拮抗RANKL引起的骨破坏,为类风湿关节炎的治疗提供了新方法。     

外周伤害性刺激诱导大鼠脑干内延髓网状背侧亚核传入投入神经元的c—fos表达

用荧光金逆行追踪和FOS荧光免疫组织化学染色相结合的方法对外周伤害性刺激下大鼠脑干内向延髓网状背侧亚核传入投射的神经元中c-fos的表达进行了研究，在麻醉状况下将0.15μl2%荧光金注入大鼠单侧延髓网状背侧亚核，存活5d后用1％福尔马林刺激同侧前爪、后爪和口周，2h后灌注取材，再行FOS免疫荧光标记。结果发现在脑的中脑导水管周围灰质、中缝背核、线形核和中缝大核内观察到荧光金记细胞、FOS样免疫阳性反应细胞及荧光金／FOS双标细胞。在这四个核团中，双标细胞数分别占荧光金逆标神经元数的25％（中脑导水管周围灰质）、11.7%（中缝背核）、8.9%（线形核）和12.1%（中缝大核）。结果提示在脑干向延髓网状背侧亚核投射的神经元中，有一部分与外周伤害性刺激信息的调控有关，还有的神经元可能具有其它的功能。     

多枝赖草基因组可转化人工染色体（TAC）文库的构建和鉴定

为了克隆和转化多枝赖草（Leymus multicaulis）耐黄矮病、耐蚜虫、耐干旱、耐盐碱等抗逆性基因，利用脉冲电泳分离纯化2Mb以上核DNA，酶切后回收10～200kbDNA片段按大小分5组与TAC载体连接后电转化导入细菌DH10B，在卡那霉素和蔗糖选择压下均有阳性克隆．用两种TAC载体pYLTAC17和pYLTAC747H／sacB分别构建了文库I和II，约16．5和23．6万个克隆，估计覆盖3～5倍多枝赖草基因组大小．文库以混合克隆形式保存在12×2块深孔96孔板中，每孔1．2mL菌液中含300～600个克隆，40多万个克隆转存到3块384孔板，留24个孔存叶绿体和线粒体DNA探针菌液，可用于后续文库鉴定．此外，从文库I和II分别挑取2501和2890个单克隆存于14块384孔板中．17块384孔板都用GeneTAC^TMG3复制了2份，点高密度杂交膜6张，以多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因5＇RACE，GR和3＇RACE＋GR为探针初步筛选到19个阳性克隆，两文库为多枝赖草抗性基因的克隆、物理图谱的构建、功能验证等基因组有关研究奠定了基础。     

抑制mTOR信号通路可增强5-aza-dC对胃癌细胞生长的抑制作用

本实验主要研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路与DNA甲基化在人胃癌细胞生存活力、细胞周期、相关基因及蛋白表达方面的相互作用．分别单独或联合DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-aza-dC）、mTOR抑制剂雷帕霉素（rapamycin，RAPA）和P13K抑制剂LY294002干预人胃癌MKN45和SGC7901细胞，以MTT检测细胞生存活力，流式细胞术检测细胞周期，real-timePCR检测PTEN，p27^Kip1基因表达情况，亚硫酸氢盐修饰后测序检测DNA甲基化改变，蛋白免疫印迹检测相关蛋白表达情况．结果发现单独应用5-aza-dC对胃癌细胞的抑制作用不明显，当其联合mTOR信号通路抑制剂时则显著抑制胃癌细胞生长（P〈0．01）；抑制mTOR信号通路可增强5-aza-dC使细胞阻滞在G2期的作用；联合用药还能提高抑癌基因PTEN,p27^Kip1的表达，但不影响DNA甲基化状态；LY294002及RAPA使Akt，p70S6K及4E-BPl磷酸化表达显著下降（P〈0．01），但5-aza-dE并不增强这一效应．以上研究提示mTOR信号通路抑制剂可间接促进DNA甲基化酶抑制剂对胃癌细胞的抑制作用，为肿瘤的治疗提供新思路．     

微卫星DNA检测方法的研究

在检测牙鲆的微卫星变异时,对聚丙烯酰胺凝胶的种类、浓度及其银染方法进行了优化.实验总结了一套适用于微卫星检测的方法.该方法具有灵敏度高、凝胶透明度高、对环境污染小、条带清晰和染色时间短等特点,能显著提高检测分辨率,具有广泛的推广价值.     

COI序列:影响动物分类学与生态学的DNA barcode

DNA barcode是一段特殊的、可用于物种鉴定的DNA序列.目前在动物中最常用的DNA barcode是细胞色素C氧化酶1号基因(COI)的部分序列.随着标准数据库的建立,基于COI基因的DNA barcode在动物分类学和生态学中得到了广泛应用.但是,采用COI基因作为DNA barcode所隐含的涉及线粒体的进化历史、遗传特性和物种成种时间的默认前提,并非完全成立,由此引发了许多问题.本文阐述了基于COI基因的DNA barcode对分类学和生态学的影响,目前存在的问题,以及可能的研究方向.