高效合成葡萄糖二酸酿酒酵母工程菌的构建

葡萄糖二酸是天然存在的一种重要二元酸,其在医疗保健和化工工业等领域具有很高的实际应用价值,因此被称为“最具价值的生物炼制产品之一”。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘微生物,文中考察了过量表达肌醇转运蛋白Itr1、融合表达肌醇加氧酶和葡萄糖醛酸脱氢酶以及弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1三种策略对葡萄糖二酸产量的影响。研究结果显示,过量表达肌醇转运蛋白Itr1使葡萄糖二酸产量在摇瓶发酵条件下较出发菌株Bga-3提高了26%;MIOX4-Udh融合蛋白的表达使葡萄糖二酸的产量较Bga-3菌株提高了40%;在此基础上,弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1后,葡萄糖二酸的产量达5.5 g/L,较相同发酵条件下Bga-3菌株提高了60%。在5 L发酵罐中,该菌株葡萄糖二酸的最高产量达10.85 g/L,较Bga-3菌株提高了80%。由此可见,上述代谢改造策略的应用在很大程度上提高了葡萄糖二酸的途径效率和产量,为通过代谢工程方法在酿酒酵母中合成其他化合物的研究提供了参考。     

葡萄糖与胰岛素对3T3—F442A脂肪细胞中Leptin表达？…

为了解葡萄糖与胰岛素对３Ｔ３－Ｆ４４２Ａ脂肪细胞中Ｌｅｐｔｉｎ表达的调节，应用ＲＴ－ＰＣＲ方法以ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ为内对照对不同葡萄糖和／或胰岛素浓度培养条件下３Ｔ３－Ｆ４４２Ａ脂肪细胞中Ｌｅｐｔｉｎ ｍＲＮＡ表达水平进行相对定量分析。     

透明质酸钠联合硫酸氨基酸葡萄糖钾胶囊对踝关节损伤患者血清骨性标志物水平及关节功能的影响

目的:探讨透明质酸钠联合硫酸氨基酸葡萄糖钾胶囊对踝关节损伤患者血清骨性标志物水平及关节功能的影响。方法:选择2015年1月至2017年1月在我院接受治疗的120例踝关节损伤患者,将其随机分为观察组和对照组,每组各60例。对照组患者采用透明质酸钠联治疗,观察组则在对照组治疗方案的基础上联合硫酸氨基酸葡萄糖钾胶囊进行治疗。检测和比较两组患者治疗前后血清骨钙素(BGP)、I型前胶原羧基端肽(PICP)、骨源性碱性磷酸酶(BALP)水平及Baird-Jackson踝关节评分的变化情况及治疗后的临床疗效。结果:治疗后,观察组的总有效率(91.67%)明显高于对照组(78.33%,P0.05)。两组患者治疗后的血清BGP、PICP、BALP水平及Baird-Jackson踝关节评分均较治疗前显著升高,且观察组明显高于对照组(P0.05)。两组治疗过程中均无明显不良反应发生。结论:透明质酸钠联合硫酸氨基酸葡萄糖钾胶囊治疗踝关节损伤患者的临床疗效显著优于单用透明质酸钠联治疗,其可有效改善血清骨性标志物水平,且利于踝关节功能的恢复。     

偶联羟化反应和辅酶再生体系产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,可以用来制备β-甾酮,地塞米松和其他类固醇化合物。3-甾酮9α-羟基化酶(KSH)是由两个亚基即末端氧化亚基(KshA)和铁氧还蛋白还原亚基(KshB)构成的。在本研究中,人工合成了来源于分枝杆菌Mycobacterium sp.Strain VKM Ac-1817D的kshA和kshB基因,通过优化表达载体促进了KshA和KshB在E.coli BL21(DE3)中的可溶性表达,并探究了催化体系中KSH还原亚基和氧化亚基的最适添加比例。此外,KSH转化雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)为9-OH-AD的过程中需要辅酶NADH。本研究构建了羟基化反应与利用葡萄糖脱氢酶(GDH)的NADH辅酶再生反应的偶联体系。为了进一步提高转化效率,本研究进行了转化条件的优化,并采取了分批补料的策略,最终9-OH-AD产量为4.78 g/L,转化率为96.7%。此种酶介导的转化生产9-OH-AD的方法为甾体药物生产提供了一种环境友好和经济实用型的新策略。     

S-亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达系统的构建及手性胺的合成

旨在构建S-亚胺还原酶(S-IRED)和葡萄糖脱氢酶(GDH)在大肠杆菌中的一菌双酶共表达系统,实现辅酶NADPH的再生,高效合成手性仲胺。利用无缝克隆的手段设计构建一种单质粒双启动子共表达系统,以全细胞为催化剂催化手性仲胺S-2-甲基吡咯烷(S-2MP)的合成,并研究温度、pH及有机溶剂对双酶反应的影响。成功构建了S-IRED和GDH的重组共表达质粒,实现了S-IRED与GDH在大肠杆菌中的胞内共表达,以亚胺2-甲基吡咯啉(2MPN)为模式底物,以工程菌全细胞催化手性仲胺S-2MP的合成,在低辅酶添加时催化手性胺的产率和光学纯度均高于95%。该双酶共表达体系的最适温度和pH分别为37℃和pH 8,10%以下的甲醇对双酶反应有正向促进作用。大肠杆菌胞内双酶共表达系统的构建实现了辅酶NADPH的原位再生,降低了亚胺还原酶催化合成手性胺的成本,为手性胺的规模制备奠定了基础。     

体外研究UGT2B7基因SNP rs28365062对霉酚酸酯代谢的影响

目的:体外研究尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT2B7)基因SNP rs28365062对霉酚酸酯(MMF)代谢的影响,明确该位点变异是否与MMF副作用具有潜在关系。方法:采用基因重组、定点突变技术构建UGT2B7基因SNP rs28365062不同等位基因过表达载体,POLO3000转染法将重组过表达载体转染HEK293细胞,采用液相色谱-质谱联用仪(LC/MS/MS)系统检测霉酚酸(MPA)代谢产物--酰基化葡萄糖醛酸化物(Ac MPAG)24小时的生成量来评估转染不同等位基因细胞的酶活性。结果:成功构建过表达载体p IRES2-EGFP-prom(A)和p IRES2-EGFP-prom(G)并转染至HEK293细胞。LC/MS/MS系统检测结果显示携带G等位基因的突变型UGT2B7代谢MMF产生Ac MPAG的能力降低,产物Ac MPAG 24小时的生成量仅为野生型的18.60%(P0.001)。结论:UGT2B7基因SNP rs28365062可显著影响MMF代谢产物Ac MPAG的生成,可能是导致病人对MMF产生不同程度副作用的因素之一。     

参芎葡萄糖注射液联合脑蛋白水解物治疗急性脑梗塞的疗效及对神经功能缺损和血液流变学的影响

目的:探析参芎葡萄糖注射液与脑蛋白水解物联合治疗急性脑梗塞患者的临床疗效和对神经功能、血液流变学的影响。方法:入选急性脑梗患者130例,随机分为两组各65例。对照组在常规治疗基础上使用脑蛋白水解物治疗,治疗组在常规治疗基础上不仅使用脑蛋白水解物,还加用参芎葡萄糖注射液治疗,比较两组患者的临床效果、神经功能缺损评分改变和血液流变学情况。结果:治疗组有效率显著高于对照组(P0.05);神经功能缺损评分治疗后均有下降,但治疗组下降幅度更大(P0.05);治疗组红细胞压积、血小板聚集率和纤维蛋白原均显著下降(P0.05),且同期相比,治疗组纤维蛋白原和红细胞压积下降幅度显著优于对照组(P0.05)。结论:参芎葡萄糖注射液与脑蛋白水解物联合治疗急性脑梗塞患者疗效确切,安全可靠,值得临床推广。     

葡萄糖对干旱胁迫下小麦种子萌发及幼苗生长的调节作用

干旱胁迫会抑制小麦种子的萌发及生长,20%聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫的同时施以不同浓度的外源葡萄糖处理小麦种子,探讨外源葡萄糖对干旱胁迫下小麦种子萌发及幼苗生长的影响。14 h光照/10 h黑暗的光周期培养条件下,较低浓度的葡萄糖(0.02 mmol/L和0.05 mmol/L)促进了干旱胁迫下小麦种子的萌发及幼苗生长,但较高浓度的葡萄糖(0.1 mmol/L,0.2 mmol/L及0.5 mmol/L)加强了干旱胁迫对小麦种子萌发及幼苗生长的抑制效应;而在黑暗条件下培养,葡萄糖的上述调节作用消失。以上结果说明葡萄糖对干旱胁迫下小麦种子萌发及幼苗生长的调节作用具有浓度效应,并且依赖于光。     

根际低氧胁迫对网纹甜瓜幼苗植株碳水化合物含量的影响

以耐低氧性明显不同的2个网纹甜瓜品种为试材,研究了低氧胁迫下植株体内碳水化合物含量的变化特征,探讨植株体内碳水化合物含量与低氧耐性之间的关系。结果表明,低氧胁迫下网纹甜瓜根系淀粉含量下降,而茎部和叶片中有淀粉积累的现象,且在耐低氧性强的‘东方星光’叶片中淀粉积累更明显;低氧胁迫下网纹甜瓜体内可溶性糖、蔗糖、果糖含量增加,且在茎部和叶片中增加幅度较大,并以耐低氧性强的‘东方星光’中增加更明显;低氧胁迫下网纹甜瓜根系葡萄糖含量降低且低于通气对照,茎部和叶片中葡萄糖含量先增加后降低,在处理8d后低于通气对照。研究发现,网纹甜瓜体内碳水化合物含量与植株的耐低氧性密切相关;耐低氧性强的品种体内可溶性糖、蔗糖、果糖含量在低氧胁迫下比耐低氧性弱的品种更高,增幅更大;体内较高的可溶性糖、蔗糖和果糖含量是植株对低氧胁迫的一种适应性反应。