沃尔巴克氏菌调控小茶尺蠖和灰茶尺蠖杂交卵孵化

【目的】明确沃尔巴克氏菌Wolbachia对茶尺蠖两近缘种杂交卵孵化的影响及相关机制。【方法】使用2.5 mg/mL四环素浸液处理1 min后的新鲜茶树叶片连续饲喂灰茶尺蠖Ectropis grisescens幼虫3代,建立不携带Wolbachia的灰茶尺蠖种群。通过携带和不携带Wolbachia的灰茶尺蠖成虫分别与小茶尺蠖E. obliqua成虫进行杂交,探究Wolbachia对二者杂交卵孵化的影响。同时利用iTRAQ技术检测并分析携带和不携带Wolbachia的灰茶尺蠖精子蛋白的差异。【结果】与自然携带Wolbachia的灰茶尺蠖相比,去除Wolbachia后的灰茶尺蠖与小茶尺蠖杂交卵孵化率从3.92%显著提高到56.20%,表明Wolbachia诱导胞 质不亲合。精子蛋白差异分析显示,携带和不携带Wolbachia的灰茶尺蠖的精子蛋白中,共有128个蛋白显著差异表达,其中KEGG数据库注释到45个差异蛋白富集到鞘脂类代谢、唾液分泌、溶酶体、鞘脂信号通路和鞘糖脂生物合成等106个通路中,其中鞘脂类代谢通路中与神经酰胺合成相关的神经酰胺酶和磷酸酯酶显著上调表达。【结论】共生菌Wolbachia通过胞质不亲和作用介导了茶尺蠖两近缘种间的合子前生殖隔离,导致杂交卵的孵化率显著下降;Wolbachia可能通过鞘脂代谢通路实现了对雄性精子蛋白的修饰。     

梅与山桃远缘杂交亲和性初步研究

为培育早花抗寒梅花新品种,以梅(Prunus mume)品种‘江梅’(P.mume‘Jiangmei’)、‘淡丰后’(P.mume‘Dan Fenghou’)与山桃(P.davidiana)、‘白花’山桃(P.davidiana‘Alba’)为亲本进行杂交试验,记录种间杂交结实率,观察花粉管生长,对未成熟胚进行培养。结果表明:(1)梅与山桃、‘白花’山桃杂交结实率很低,‘江梅’ב白花’山桃未结果,结实率最高的组合为‘淡丰后’×山桃,也仅有7.4%,且杂交果实的果核内部分胚干瘪、败育。(2)山桃和‘白花’山桃的花粉在梅柱头上都能正常萌发,但花粉管生长受抑制,多数花粉管到达花柱中部即弯曲、缠绕、断裂,花粉管生长过程中有大量的胼胝质产生,表现较低的杂交亲和性,但不同种间杂交亲和程度又有所不同。(3)通过未成熟胚培养获得了杂种苗。研究表明,梅与同属种杂交存在不亲和性,幼胚拯救是获得梅与李属其他种远缘杂交杂种苗的有效途径。     

24份甜樱桃材料自交不亲和S基因型鉴定

甜樱桃品种绝大部分自交不亲和,限制了甜樱桃的正确评价和合理利用,因此自交不亲和基因型的鉴定对于生产具有重要意义。以24个甜樱桃主栽品种为材料,用5对蔷薇科李属引物组合对24个甜樱桃品种进行了S等位基因的PCR扩增,克隆S基因的扩增片段,用核酸序列在Gen Bank上搜索,确定了5种S基因的核酸序列和大小。结果表明:Pru C2+Pru C4R引物组合扩增效果最好;在琼脂糖凝胶上位置相同的扩增带其核酸序列相同,是同一种S基因;5种S基因扩增片段的大小分别是S1为800 bp,S3为762 bp,S4为962bp,S5为300 bp,S6为456 bp,S9为650 bp;24个甜樱桃S基因型是红手球、早红宝石为S1S3,拉宾斯S1S4',红宝石S1S6,布鲁克斯S1S9,那翁S3S4,秦林、泰安大紫、先锋、早大果、丽珠、美早、5-106、左滕锦、桑提娜为S3S6,黑珍珠、红灯、萨米脱、秦樱为S3S9,胜利为S5S9,明珠、红蜜、雷尼、滨库为S6S9。     

基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化、纯化和检测方法

目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共转染人胚肾293T细胞,12 h后观察Avi-tag标签对eGFP蛋白在细胞内定位的影响;48 h后裂解细胞,用链霉亲和素珠子纯化生物素标记的eGFP,SDS-PAGE观察eGFP纯化和富集情况,并优化基于Western印迹的生物素化eGFP检测方法。结果:Avi-tag标签对eGFP在细胞内的定位无影响,同时BirA酶在293T细胞内可将带Avi-tag标签的eGFP标记上生物素;生物素化的eGFP可特异性地被链霉亲和素珠子纯化和富集,纯度可达95%;Western印迹检测生物素化蛋白的最终条件为5%的BSA作为封闭液和终浓度为100 ng/mL的链霉亲和素-HRP。结论:建立了基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化标记、纯化与检测方法,为该方法的广泛应用奠定了前期技术基础。     

雌先熟植物茄参（茄科）的繁育系统

对分布于云南西北部的茄参（Mandragoraca caulescens）的繁育系统进行了研究。茄参的花期为5月底到6月初,单花持续时间为（9．9±2．8）d,其性表达方式为雌性先熟。有三种昆虫拜访茄参的花,白背熊蜂蜂王是最有效的传粉昆虫,但其访花频率很低;苍蝇和蚂蚁的访花频率较高,但苍蝇传粉效率十分有限;蚂蚁是窃蜜者。授粉实验证明茄参具有部分自交亲和能力,但由于雌性先熟,不具备主动自交能力。人工添加异交花粉显著提高了结实率和结籽数,证明茄参存在花粉限制。茄科的大部分植物是严格自交不亲和的,但茄参族的茄参是自交部分亲和,这和茄科天仙子族的部分成员类似。我们认为这两个独立起源于新世界向欧亚大陆扩散事件的族,各自从自交不亲和向自交亲和转变可能与高山地区恶劣的自然条件有关,这种繁育系统的进化模式是否具有普遍性值得进一步研究。     

新模式植物短柄二叶草SGT1 和RAR1 基因沉默和蛋白纯化载体构建

短柄二叶草作为一种新型的模式植物,已成为当前研究热点.其具有基因组小、生长周期短、生存环境简单和容易人工转化等重要生理和遗传特性,被认为是一种潜力巨大的人类研究能源和粮食作物的重要模式植物.SGT1和RAR1基因是高度保守的并与植物抗病功能紧密相关的重要基因.本文采用Gateway克隆技术构建了SGT1和RAR1的基因沉默表达载体.阳性克隆载体经PCR、酶切和测序鉴定.为进一步研究SGT1和RAR1互作蛋白及其功能,采用该克隆技术将基因cDNA全长克隆至串联亲和纯化蛋白表达载体pEarleyGate205中,为纯化SGT1和RAR1及其互作蛋白提供了基础.正确的阳性克隆载体经农杆菌介导转化至短柄二叶草Bd21获得转化株,以期进一步研究SGT1和RAR1基因及蛋白互作对于短柄二叶草抗病功能的影响.     

雌先熟植物茄参 （茄科）的繁育系统

对分布于云南西北部的茄参（Mandragora caulescens）的繁育系统进行了研究。茄参的花期为5月底到6月初,单花持续时间为（9.9±2.8）d,其性表达方式为雌性先熟。有三种昆虫拜访茄参的花,白背熊蜂蜂王是最有效的传粉昆虫,但其访花频率很低;苍蝇和蚂蚁的访花频率较高,但苍蝇传粉效率十分有限;蚂蚁是窃蜜者。授粉实验证明茄参具有部分自交亲和能力,但由于雌性先熟,不具备主动自交能力。人工添加异交花粉显著提高了结实率和结籽数,证明茄参存在花粉限制。茄科的大部分植物是严格自交不亲和的,但茄参族的茄参是自交部分亲和,这和茄科天仙子族的部分成员类似。我们认为这两个独立起源于新世界向欧亚大陆扩散事件的族,各自从自交不亲和向自交亲和转变可能与高山地区恶劣的自然条件有关,这种繁育系统的进化模式是否具有普遍性值得进一步研究。     

基于纳米颗粒的赭曲霉毒素A高灵敏酶联免疫检测方法的建立及应用

赭曲霉毒素(ochratoxins)主要是由青霉菌Penicillium和曲霉菌Aspergillus产生的有毒次级代谢产物,常见于发霉或发酵的农产品中,其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)毒性最强且最为普遍。OTA是粮食作物和饲料的重要污染物,在加工、储存或运输过程中均可产生,具有肾毒性和免疫毒性,可通过蓄积作用发挥毒性效应,对人类和动物健康造成严重威胁。本研究通过将OTA单克隆抗体包被于纳米磁珠(magnetic nanoparticles,MNPs)表面,获得具有免疫活性的磁珠抗体复合物(MNPs-Anti OTA),并制备生物素标记的偶联抗原OTA-BSA-Bio,后续采用链酶亲和素标记的纳米金颗粒(Strep-HRP-AuNPs)催化底物进行信号检测,最终建立了OTA高灵敏检测方法(MNPs-bs-AuNPs-ELISA)。在最优条件下,经计算该方法检测下限(IC10)为0.01ng/mL,检测区间(IC20-IC80)为0.02-0.73ng/mL,半数抑制率(IC50)为0.13ng/mL。与OTA类似物OTB、OTC交叉反应性为4.3%和8.1%,对其他常见真菌毒素AFB1、ZEN、FB1、DON、CIT和PAT均无交叉反应。玉米、面粉和大豆样本中的加标回收率可达85.6%-115.7%,对天然样本中OTA含量的检测结果表明,该方法与LC-MS/MS相关性良好。本研究建立的MNPs-bs-AuNPs-ELISA可满足谷物及饲料样本中OTA的快速、高灵敏度定量检测,成本较低,具有很好的应用前景。     

大白菜BrCML49基因的分离鉴定及表达特征分析

类钙调蛋白(Calmodulin like protein,CML)是植物细胞中一类非常重要的钙感受蛋白,且CML蛋白在花粉萌发和花粉管生长中起到重要作用。该研究以大白菜自交不亲和系‘91 125’自花授粉后柱头为材料,克隆获得大白菜BrCML49基因cDNA全长序列1 046 bp,包括960 bp开放阅读框,编码319个氨基酸,包含2个EF hand保守结构域。序列分析发现,BrCML49蛋白为稳定的亲水蛋白,没有跨膜区。实时荧光定量(qRT PCR)表达分析显示,BrCML49基因的表达量在‘91 125’的花药中最高,其次是全花和花瓣,在其他组织中表达量较低;BrCML49基因在大白菜自交亲和系‘14S23’的全花和柱头中表达量较高,在其他组织中表达量较低。亚细胞定位分析发现BrCML49主要定位于烟草叶片的细胞膜和细胞核中。该研究结果可为进一步研究大白菜BrCML49基因的功能奠定基础,并为阐明大白菜BrCML49基因参与自交不亲和花粉萌发及花粉管生长的信号机制提供理论依据。     

5个菊花品种自交结实特性及减数分裂行为与花粉育性研究

对rm1-1、rm1-3、02-42-6、rm1-4和rm48-2等5个菊花品种3年自交结实率及花粉母细胞的减数分裂行为和花粉活力进行了研究.结果显示:(1)rm1-1、rm1-3和02-42-6属自交结实品种,结实性主要来源筒状小花;rm1-4和rm48-2为自交不结实品种.(2)在减数分裂过程中,rm1-1、rm1-3和02-42-6中期Ⅰ每个花粉母细胞(PMC)平均染色体配对构型分别为0.93Ⅰ+23.64Ⅱ+0.85Ⅲ+0.64Ⅳ、0.92Ⅰ+ 24.40Ⅱ+ 0.78Ⅲ+0.51Ⅳ和0.45Ⅰ+ 25.04Ⅱ+0.36Ⅲ+0.55Ⅳ;rm1-4和rm48-2每个PMC平均染色体配对构型分别为0.53Ⅰ+25.25Ⅱ+0.84Ⅲ+0.16Ⅳ和1.39Ⅰ+24.87Ⅱ+0.42Ⅲ+0.40Ⅳ;后期和末期5个品种花粉母细胞均出现不同频率的染色体桥、落后染色体、微核等异常现象,但大部分花粉母细胞均能正常发育.(3)5个品种花粉萌发率为8.1%～28.9%,其中rm1-1最低,rm1-4最高.结果表明,减数分裂过程和花粉育性与自交结实率没有必然关系.