利用磁珠构建稻瘟菌cDNA文库

本文以稻瘟菌菌丝体为材料提取RNA,[目的]改进张学敏等人的方法,通过磁珠构建稻瘟菌cDNA文库,并用于下一步研究稻瘟菌与水稻之间的互作关系.[方法]通过共价键连接的寡聚oligo(dT)磁珠纯化mRNA,并以磁珠上的oligo(dT)为引物引导第一链cDNA的合成,再利用末端转移酶加尾法合成第二链cDNA.构建过程中避免使用限制酶和连接接头.[结果]用此方法构建的文库容量为8.9×107cfu,滴度为8.9×106 cfu/mL,随机挑取的25个克隆插入片断平均大小达到1380bp.[结论]实验结果表明用改进的方法可构建高质量的cDNA文库,并且方便快捷,所用材料少,构建时间短,利于大规模的功能基因分析.     

小麦eIF3c基因片段的克隆及序列分析

根据真核翻译起始因子eIF3c的保守序列,搜索小麦EST,由拼接的序列设计引物,从普通小麦‘川麦107'幼苗总RNA中克隆出1102bp的小麦eIF3c1基因片段命名为WeIF3c1.序列分析表明,该片段推断的氨基酸序列与两个拟南芥、水稻、甜樱桃、人类、线虫、老鼠等物种的真核翻译起始因子eIF3c相比较同源性分别为69、61%、85%、72%、38%、36%和38%.     

黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因的克隆与序列分析

以黑曲霉(A.niger)TCCC41013的总RNA作为模板,通过RT-PCR扩增出含自身信号肽的脯氨酸蛋白内肽酶基因,将其插入pUCm-T载体上,经PCR和酶切鉴定后进行测序并分析.所克隆的PEP基因全长为1 581bp,编码526个氨基酸残基,成熟肽为504个氨基酸残基.与GeneBank中已报道的A.niger CBS513.88的PEP序列同源性最高,达到99.75%.脯氨酸蛋白内肽酶是一种新型的丝氨酸蛋白酶,黑曲霉PEP与已克隆的其他菌种的PEP同源性不高.     

克隆种群的有关概念在水生植物中应用和研究进展

自20世纪80年代以来,克隆植物(C lonal p lants)种群生态学的研究逐渐成为国外生态学研究的热点之一,其研究成果不断发表在各种重要的国际学术刊物上[1—3],从而引起国内学者的关注。现已在陆生植物的多个类群中展开,但是水生植物的克隆种群研究仍然相对较少。随着我国淡水生态系统环境的恶化,水生植物在一些水域逐渐退化甚至完全消失,淡水生态系统的功能受到了严重的破坏[4],与此同时很多入侵性水生植物却疯狂生长,严重影响了水生生态系统的安全与利用。克隆生长和无性繁殖在水生植物中是十分普遍的现象[5—8],因此深入开展水生植物的克隆生态学研究对水生植被的恢复及外来种的管理具有重要的意义。1克隆种群的一些概念对植物克隆现象的重视首先源自于对植物构件性的研究。20世纪70年代Harper,et a·l提出了植物种群统计的构件理论(Modu le theory)[9]。构件理论把种群划分为由遗传单位形成的个体种群和由无性繁殖形成的构件种群两种结构水平,较好地解释种群内部个体的大小和数量在同龄或异龄植株之间的差异,因此被迅速接受并广泛地运用于植物种群生态学研究的多个方面。此后,对构件植物种群,特别是对克隆植物种群的...     

重组野猪α-干扰素基因的高效表达和下游工艺的研发

利用PCR方法，从东北野猪和长白猪的肌肉基因组DNA中分别扩增出一条501bp的基因片断 ，与GenBank上登载的猪α-干扰素基因序列相比,核苷酸同源性达到98.4%以上。以其中野猪α-干扰素基因片断为参考模板，经过密码子优化、5?和3?区域的mRNA二级结构优化，全基因合成得到编码野猪α-干扰素基因成熟肽的基因。克隆该基因到原核表达载体pWL之中.随后转化至宿主菌DH-5α。经过SDS-PAGE电泳检测，发酵后的重组野猪IFN-α-干扰素基因的蛋白表达量大于25%。复性纯化后的重组蛋白，经过VSV-WISH系统检测，其生物活性为4.45×106IU/mg。     

草鱼TRIM32基因克隆表达及功能研究

TRIM (Tripartite-motif protein) 家族是机体先天性免疫的重要成员, 参与细胞增殖分化、细胞凋亡、肿瘤抑制、抗病毒等过程。为了进一步探究TRIM蛋白在鱼类免疫中的作用, 实验利用PCR方法克隆了草鱼TRIM32基因的编码区全长, 共1980 bp, 编码660个氨基酸。草鱼TRIM32具有TRIM家族典型的3个结构域, 与斑马鱼TRIM32的核苷酸序列同源性较高, 遗传进化分析也聚为一支。间接免疫荧光、Western-blotting检测结果显示草鱼TRIM32在EPC细胞中成功表达, 主要以点状分布在细胞质中, 细胞核中表达量较少; 组织分布分析表明TRIM32在被检测的11个组织中均有表达, 其中在头肾组织中的表达量明显高于其他组织; 不同胚胎发育时期的表达分析进一步表明, TRIM32在受精卵时期、卵裂期和囊胚期的表达量显著高于其他时期(P<0.05), 随后表达量下降, 直到出膜后表达量再次显著性升高。此外, 双荧光素酶检测系统显示TRIM32能够激活NF-κB信号通路, 诱导下游的炎症反应。结果显示, 草鱼TRIM32广泛分布于鱼体内, 并参与机体的天然免疫反应, 对于抵抗病原体的入侵具有重要作用。     

一个玉米矮秆突变体K123d的遗传鉴定

矮秆已被广泛用于改良作物的抗倒伏性状,培育理想株型,从而提高作物产量。玉米矮秆突变体K123d由自交系K123自然突变产生。本研究比较该突变体与野生型主要农艺性状差异及其对赤霉素的敏感性;用K123d与株高不同的3个自交系分别构建F1、BC和F2群体,分析矮秆性状的遗传模式;以K169/K123d-F2为定位群体,采用集团分离分析法(BSA),运用SSR标记定位矮秆基因d123;参照br-2序列信息分段设计特异引物,同源克隆d123。结果表明,与野生型相比K123d株高降低35.59%,穗位高降低、节间缩短、叶片较直立,但结实率差,对赤霉素敏感;在F2群体和BC1群体中,正常植株与矮秆植株分离比例分别符合3∶1和1∶1,说明矮秆性状受1对隐性基因控制;其矮秆基因d123定位于第一条染色体上SSR标记umc1278和bnlg1564之间,遗传距离分别为12.8 c M和7.3 c M;同源克隆显示d123与br-2存在12个碱基替换,其中第4个外显子编码的一个谷氨酸被替换为赖氨酸。由此可见,矮秆突变体K123d为br-2的一个突变类型,对矮化育种具有进一步研究利用价值。     

抗菌肽CP10A在大肠杆菌中的融合表达

CP10A是一种由抗菌肽Indolicine经过序列改造，且对多数革兰氏阳性病源细菌具有较强抗菌活性的多肽序列。本研究根据已报道的CP10A氨基酸序列，兼顾大肠杆菌密码子偏好性，设计CP10A的核苷酸序列，利用PCR技术合成相应的DNA序列，后克隆构建重组表达载体pET32a（+）-CP10A，转入大肠杆菌AD494菌株。经IPTG诱导表达和15% SDS-PAGE电泳检测后发现产物以包涵体形式存在，且融合表达量占总蛋白的50%。在变性条件下经Ni-NTA亲合柱层析及复性，最终获得了较高纯度的可溶性重组蛋白。本研究首次实现了CP10A抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达，为进一步研究其生物学活性及应用奠定了一定的基础,同时也为研究抗菌肽表达提供了一种方法。     

青鳉prdm14的原核表达、多克隆抗体制备及其应用

青鳉(Oryzias latipes)是研究遗传发育和细胞多能性的重要模式鱼类, 为探究prdm14同源基因的潜在作用, 实验将青鳉prmd14经原核表达后制备了兔抗Prdm14多克隆抗体。首先, 将prdm14基因的部分编码区连接到pET32a质粒中, 构建重组表达载体pET32a-prdm14?600。随后将重组载体转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3), 经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)诱导表达, 获得分子量为60 kD的Prdm14重组蛋白。接着大量诱导蛋白表达并切胶纯化, 免疫家兔(Oryctolagus cuniculus), 6周后获得阳性抗体, 最后通过ELISA和Western blot检测抗体效价及其特异性。结果显示, 在37℃、0.6 mmol/L IPTG、诱导3h的条件下, 可获得Prdm14重组蛋白的高效表达; 制备的兔抗青鳉Prdm14多克隆抗体能够特异性识别青鳉组织中表达的Prdm14蛋白以及在HepG2细胞中过表达的青鳉Prdm14: EGFP融合蛋白。综上所述, 研究首次制备了一种能有效识别青鳉Prdm14的多克隆抗体, 该抗体的获得为后续研究prdm14基因在鱼类多能性干细胞中的作用提供了有力工具。     

胰腺干细胞生物学特性研究进展

胰腺干细胞是一类来源于胎儿或成年胰腺组织中的成体干细胞.多数研究认为胰腺干细胞体外培养时,贴壁生长,呈多角形上皮样,具有较高的扩增性;表达胰腺发育过程中的一些决定因子Pdx1、HNF3β、Ngn3、Th及Isll等,还共表达胰腺终末细胞释放的激素glucagon、insulin等,甚至共表达来源于其它胚层细胞的表达物CK19、nestin等;具有多分化潜能,其特点是在自然分化过程中,优先分化为胰腺组织细胞,在特定的条件下,也可转分化为其它组织细胞.胰腺干细胞生物学的不断深入研究,为分离、克隆胰腺干细胞及定向诱导其分化为功能性胰岛移植治疗人类糖尿病奠定了基础.