基于显微图像的牛蛙肠系膜微循环观察

在动物活体上进行微循环观察是微循环研究的主要手段,肠系膜是脏器微循环的良好观察部位。通过医学图像分析系统可直接观察、录像、测量并记录正常状态下牛蛙肠系膜微血管的口径及开放数量、血流流态与流速、血流量等指标,并可观察滴加药物后上述指标发生的变化,探讨微循环的功能状态及药物等因素对微循环的影响。     

蛙病毒同源蛋白RGV-27R和ADRV-85L的表达及其免疫原性分析

沼泽绿牛蛙病毒(Rana grylio virus,RGV)和大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus,ADRV)同属虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)成员,是引起水产动物高死亡率的病原。其同源早期蛋白RGV-27R和ADRV-85L与蛙病毒代表株蛙病毒3型(Frog virus 3,FV3)25R基因所编码的大小为31kD的早期蛋白P31K(FV3-P31K)同一性超过99%。我们在观察和比较RGV与ADRV感染大鲵胸腺细胞(Giant salamander thymus cell,GSTC)显微病变的基础上,将ADRV-85L和RGV-27R基因分别克隆到原核表达载体pET-32a与pMAL-p5X中,转化宿主菌E·coli BL21(DE3)并诱导表达,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测,对这两种蛋白的原核表达及其产物免疫原性进行分析。结果显示这两种基因在载体pET-32a中的表达效率要显著高于pMAL-p5X。随后,取高效诱导表达的pET-32a-RGV-27R产物,经Ni-NTA His-Bind亲和层析分离提纯,获得浓度为1.2 mg/mL的融合蛋白His-RGV-27R,用其免疫动物,制备了抗体27R-Ab,酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗体的效价为1∶6.25×10~6。用经正常大肠杆菌菌液和正常GSTC细胞悬液吸附处理后的抗体作为一抗,对被RGV或ADRV感染的GSTC细胞悬液进行Western Blot检测,并以重组原核质粒表达的融合蛋白His-RGV-27R和HisADRV-85L作为阳性对照,以正常GSTC细胞悬液为阴性对照,分别从RGV或ADRV感染的GSTC细胞悬液中,检出大小同为31kD的特异性蛋白条带。本研究证实两种蛙病毒同源早期蛋白RGV-27R和ADRV-85L不仅都能在两栖动物细胞中表达,且具有相同的抗原特性,这为深入研究这类病毒蛋白对蛙病毒复制的影响及其与宿主相互作用的分子机制提供了实验材料。     

简易制备牛蛙精巢染色体——观察动物细胞减数分裂

简化常规染色体滴片的操作程序,对牛蛙精巢进行染色体制片,基本观察到精巢组织中细胞行减数分裂各阶段的染色体行为。实验结果表明．用牛蛙精巢制备染色体能相对简捷稳定的获得有效的实验结果．是一种观察动物细胞减数分裂行为的好方法。     

一株牛蛙源金黄杆菌的分离鉴定及其致病特性

【背景】美国牛蛙养殖过程中病害问题非常突出,尤其是细菌性病害,其病原种类多、病原菌复杂多样、蔓延速度快、发病死亡率高,一直是牛蛙养殖过程中防控的难点。【目的】确定从患病牛蛙体内分离到的一株细菌NW1203的分类地位和致病性。【方法】无菌操作从牛蛙体内取样划线分离细菌,通过形态观察、生理生化试验、16S rRNA基因序列比对进行种属鉴定,通过人工感染、溶血性试验和病理切片观察分析其致病特性。【结果】经形态和生理生化鉴定及16S rRNA基因序列比对,菌株NW1203为金黄杆菌属细菌,与Chryseobacterium sp. F30的相似性达100%,进化树也显示该菌与金黄杆菌属细菌聚类;溶血性试验表明,菌株NW1203对绵羊、小鼠和牛蛙的血细胞都呈完全溶血;人工感染试验及感染病蛙的组织切片观察显示,菌株NW1203对牛蛙具有较强致病性,可引起牛蛙肝、肾、脾等主要组织严重病变,LD50为4.753×103 CFU/g。【结论】明确了菌株NW1203为牛蛙新病原,为牛蛙疾病的防控提供了理论依据。     

一株新的重组蛙病毒△67R-RGV的构建及基因67R的初步功能鉴定

沼泽绿牛蛙病毒(Rana grylio virus,RGV)属于虹彩病毒科(Iridoviridae),蛙病毒属(Ranavirus),其基因组中含编码尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)的基因67R。通过构建缺失67R的重组病毒Δ67R-RGV,探讨67R在RGV复制和感染过程中的功能。首先构建携带有作为标记的绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因的质粒(pGL3-67RL-p50-EGFP-67RR),然后将该质粒与RGV基因组在67R位点进行同源重组(homologous recombination),并接种到培养的鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC)单层细胞中。利用荧光显微观察,判断并筛选有感染性的重组病毒(Δ67R-RGV)。经过十轮挑斑分离,直至在普通显微镜下观察到的细胞病变空斑与荧光显微镜观察到的绿色荧光空斑完全吻合,获得一株新的、纯化的重组蛙病毒Δ67R-RGV。再以野生型蛙病毒(wt-RGV)为对照,分别扩增并提取wt-RGV和Δ67R-RGV的基因组DNA,进行PCR检测。结果显示,在wt-RGV基因组中可检测到67R;但在Δ67R-RGV基因组中仅检测到EGFP,却检测不到67R,证实在构建重组病毒时,EGFP的确按预期插入67R位点。进一步分别测定了wt-RGV与Δ67R-RGV的一步生长曲线,结果无显著差别,表明67R及其编码产物dUTPase的缺失并不影响RGV的正常复制,67R为病毒非必需基因。     

牛蛙致病变形菌的鉴定及其敏感药物筛选

【目的】分离鉴定引起牛蛙(Rana catesbeiana)皮肤溃疡病症的致病菌,筛选抗菌药物。【方法】采用无菌解剖组织划线分离法分离致病菌,通过人工感染试验、菌体和菌落形态观察、API20E系统鉴定、16S r RNA基因序列分析,确定分离菌的致病性及分类地位,并对该菌进行药物敏感性试验。【结果】从患病濒死牛蛙体内分离细菌NWG20141026,通过形态特征观察、生理生化试验、API 20E系统鉴定和16S r RNA基因序列相似性分析,认为NWG20141026菌株为普通变形菌(Proteus vulgaris)。人工感染试验显示,NWG20141026菌株不仅可以通过皮肤伤口感染引起蛙体表溃疡溃烂病症,也可通过消化道感染引起蛙肠炎病。药敏实验结果表明,氟苯尼考、四环素、多西环素、萘啶酸、磺胺异噁唑、恩诺沙星、红霉素等7种药物对普通变形菌具有较好的抑杀菌作用。【结论】引起牛蛙(R.catesbeiana)皮肤溃疡病症的致病菌NWG20141026为普通变形菌(P.vulgaris),所患疾病命名为牛蛙变形菌病。普通变形菌对健康牛蛙具有较强致病性,氟苯尼考、四环素、多西环素、萘啶酸、磺胺异噁唑等5种药可作为防治牛蛙变形菌病的候选药物。     

牛蛙肥大细胞的组织化学与形态学

目的鉴定牛蛙组织中肥大细胞的存在。方法用于肥大细胞研究的一些常规组织化学技术与形态学方法。结果牛蛙的舌、肠、肠系膜和脾中肥大细胞数量较多,少量也见于神经、心、肾、肝和皮肤等多种组织中。肥大细胞有沿血管周和神经分布的倾向。脾脏中的肥大细胞形状比较一致,呈圆形或卵圆形,而在其它部位的肥大细胞则形态多样。Bouin氏液及Carnoy氏液是牛蛙肥大细胞优良的固定液。然而,与哺乳动物的黏膜肥大细胞相似的是,中性缓冲福尔马林(NBF)固定显著的阻断了牛蛙肠黏膜肥大细胞(MMC)的染色。有趣的是,甲苯胺蓝是牛蛙肥大细胞的最佳染料,它比阿尔新蓝能很好地显示牛蛙的肥大细胞。透射电镜下证实,牛蛙肥大细胞中含有大量特征性的胞浆颗粒。肥大细胞靠近雪旺氏细胞,并可见于神经束膜间,甚至以其突起与神经束膜相连。结论通过组织化学与形态学研究证实了牛蛙组织中肥大细胞的存在,再次证实肥大细胞与外周神经之间存在密切的解剖学关系。     

牛蛙冬眠期及其前后的消化道嗜银细胞分布

为研究两栖类在冬眠期及其前后消化道嗜银细胞是否参与冬眠期的消化调节,本文以牛蛙(Rana catesbeiana)为实验对象,采用Grimelius银染法,对冬眠期前(n = 10)、冬眠期(n = 10)和冬眠期后(n = 10)牛蛙消化道嗜银细胞的形态及密度进行比较研究。结果表明,牛蛙消化道各部位均有嗜银细胞分布;牛蛙消化道嗜银细胞形态在冬眠期、冬眠期前及冬眠期后无差异,均为锥体型、梭型和椭圆型;牛蛙消化道各部位具有外分泌功能的锥体型和梭形嗜银细胞密度在3个时期均显著高于具有内分泌功能的椭圆型嗜银细胞密度(P < 0.01);3个时期牛蛙消化道嗜银细胞分布密度高峰均位于空肠处,但低谷有所不同,冬眠期前和冬眠期后牛蛙消化道嗜银细胞的分布密度低谷位于食管,而冬眠期其分布密度低谷位于贲门;3个时期相比,冬眠期前和冬眠期幽门处分布密度差异不显著(P > 0.05),其余部位均有差异,且食管、胃、十二指肠、空肠、回肠和直肠中嗜银细胞分布密度在冬眠期显著高于冬眠期前和冬眠期后(P < 0.05);冬眠期前和冬眠期后消化道嗜银细胞分布密度呈倒“U”型趋势,冬眠期分布密度呈现“~”型趋势。结合相关研究,推测牛蛙嗜银细胞分布密度的改变可能与机体适应不同生理状态及消化功能的调节有关。     

牛蛙的营养成份

我们在“牛蛙人工养殖”的研究过程中,分析了牛蛙的一般营养成份,并进行了氨基酸含量分析。