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1.
【背景】禽β防御素6是禽体内分泌的一类抗菌肽,在抵抗病原入侵和免疫调节中发挥着重要作用,但其常规表达方式效率较低,难以在产业化生产中加以应用。【目的】建立稳定表达AvBD6的细胞系,并检测其表达产物对耐药大肠杆菌的抗菌活性,为其他防御素表达提供参考。【方法】利用显微镜观察构建真核重组表达载体pLOV-eGFP-AvBD6转染至293T细胞后的转染效率;收集293T细胞上清液并感染DF-1细胞,通过嘌呤霉素加压筛选稳定表达株;利用RT-PCR和Western Blot分别检测目的基因在转录水平和蛋白水平的表达情况;利用扫描电镜观察细胞培养上清液对耐药大肠杆菌的抗菌效果及其对菌体的损伤。【结果】成功构建重组表达载体pLOV-eGFP-AvBD6,筛选出稳定表达AvBD6的DF-1细胞系,而且目的基因在转录水平和蛋白水平均有表达;细胞培养上清显著降低大肠杆菌和副伤寒沙门菌存活率,对金黄色葡萄球菌的抗菌活性较低。【结论】建立了稳定表达AvBD6的DF-1细胞系,其表达产物对耐药大肠杆菌具有良好的抗菌效果,对推动防御素的应用提供技术支持。 相似文献
2.
枯草芽胞杆菌作为一种遗传背景清晰、基因编辑成熟的革兰氏阳性菌,是多种重要工业酶的生产宿主。随着转录组、蛋白质组、代谢组等多组学测序和分析技术的发展,通过合理设计简化枯草芽胞杆菌基因组,减少细胞内冗余的调控和代谢网络,使得细胞更精简且便于控制,展现出了枯草芽胞杆菌作为异源酶表达宿主细胞的应用潜力。本文简要综述了枯草芽胞杆菌基因组删减的研究进展,归纳了必需基因的确定方法,重点介绍了枯草芽胞杆菌通过删减基因组提升异源酶表达的研究进展及删减策略,充分展示了枯草芽胞杆菌基因组删减在构建异源酶表达底盘细胞中的重要作用。 相似文献
3.
乳酸菌食品级表达载体的研究与应用 总被引:1,自引:1,他引:0
乳酸菌是能够发酵糖类产生大量有机酸的革兰氏阳性菌的通称,在发酵食品中有着悠久的应用历史。乳酸菌通常被认为是安全菌株,这些微生物的基因工程操作在食品、医学等方面具有广阔的应用前景。表达载体是基因工程中常用的工具之一,大多数乳酸菌的表达载体通常以抗生素抗性基因作为选择标记,然而抗性基因具有潜在的转移性,因此需要开发食品级表达载体。食品级表达载体不含有抗生素的抗性基因,仅包含来自同源宿主或通常被认为是安全生物的DNA。本文介绍了乳酸菌食品级表达载体的构成及其常用宿主,同时对乳酸菌食品级表达载体的应用进行了归纳总结。 相似文献
4.
芽胞杆菌属具有良好的蛋白表达和分泌能力,在工业酶的生产中被广泛应用,是理想的工业宿主菌,但实现蛋白分泌表达的普遍高效性还存在许多瓶颈。本文综述了芽胞杆菌的蛋白分泌表达策略,从启动子、信号肽、分泌途径、宿主和培养条件这5个方面总结了提高芽胞杆菌中分泌表达重组蛋白的方法,对芽胞杆菌高效生产工业酶有一定的参考价值,最后展望了优化芽胞杆菌分泌表达的研究方向,各种新型生物技术的发展必将推进芽胞杆菌在分泌表达领域有更深入的应用。 相似文献
5.
[背景] 工业酵母菌株的蛋白质表达通常存在表达量低、分泌效率低的问题。[目的] 考察失活Yapsin蛋白酶Yps1p和Yps2p对β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母An-α菌株中表达的影响。[方法] 利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,首先构建得到未折叠蛋白响应(Unfolded Protein Response,UPR)指示菌株An-α(leu2::UPRE-lacZ)即An-αL,然后分别失活其YPS1和YPS2基因,导入以YEplac195为载体的β-葡萄糖苷酶表达质粒(简称BG),进行生长和酶活分析评价。[结果] 菌株An-αL的YPS1和YPS2基因失活对其在酵母浸出粉胨葡萄糖(Yeast Extract Peptone Dextrose,YPD)培养基中的生长未造成明显的不利影响;导入质粒BG后将在酵母浸出粉胨纤维二糖(Yeast Extract Peptone Cellobiose,YPC)培养基中生长的最大OD600分别提高了21.9%和7.4%;最大总酶活值为0.087 5和0.068 6 U/(mL·OD600),是对照菌株相应值的2.268倍和1.778倍;分泌比例提高了19.4%和22.2%;β-葡萄糖苷酶表达水平与β-半乳糖苷酶酶活水平所代表的UPR信号响应值之间呈现良好的相关性。[结论] YPS1和YPS2基因失活有助于改进酿酒酵母An-α菌株中β-葡萄糖苷酶的分泌表达。 相似文献
6.
米曲霉作为一种重要的工业微生物,在异源蛋白表达方面已有广泛应用,受限于被表达蛋白的修饰及分泌过程,目前实际生产使用的基因供体主要局限于其他真菌,尤其是丝状真菌。当外源基因来源于植物、昆虫和哺乳动物时,米曲霉所生产的异源蛋白产量及生物活性往往不尽如人意。本文综述了米曲霉作为宿主表达异源蛋白的研究进展,包括其现有的遗传操作手段及异源表达方面的应用及探索,重点介绍了应用过程中面临的挑战和解决策略,另外,对米曲霉表达异源蛋白的应用前景及发展方向进行了展望。 相似文献
7.
【目的】本研究旨在对双委夜蛾Athetis dissimilis气味结合蛋白OBP6进行原核表达、抗体制备以及表达谱分析,便于今后对AdisOBP6功能展开研究。【方法】利用生物信息学软件分析AdisOBP6蛋白结构特征;利用通过原核表达获得的重组蛋白4次免疫新西兰大白兔,制备AdisOBP6抗体;采用荧光定量PCR和Western blot技术检测AdisOBP6在双委夜蛾雌雄成虫触角、不同时期精巢以及受精卵和未受精卵中的表达情况。【结果】同源建模预测显示,AdisOBP6具有6个保守半胱氨酸残基和7个α-螺旋结构,并
折叠成一个结合口袋。原核表达结果显示,在20℃下0.5 mmol/L IPTG诱导重组蛋白表达量最多、最稳定。4次免疫重复中,抗体效价分别超过1∶512 000, 1∶512 000, 1∶512 000和1∶64 000。Westernblot检测获得的抗体与AdisOBP6蛋白能够特异性结合。荧光定量PCR结果显示,AdisOBP6在双委夜蛾精巢中的表达量远高于在触角中的,在幼虫期精巢中AdisOBP6就已经开始表达,在蛹期精巢中表达量低于在幼虫期的, 成虫羽化后精巢中的表达量逐渐进入高峰,在未受精卵和受精卵中几乎不表达或表达量极低。Western blot分析发现,AdisOBP6蛋白也主要在精巢中表达,在雌雄成虫触角、受精卵和未受精卵中表达量很低。【结论】本研究实现了AdisOBP6的原核表达,成功地制备了抗体;并证实AdisOBP6在双委夜蛾精巢中大量表达,成虫羽化后表达量达到高峰,推测AdisOBP6可能参与了授精过程。本研究结果为今后进一步研究AdisOBP6的功能奠定了基础。 相似文献
8.
【目的】本研究旨在明确气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)在桃蛀螟Conogethespunctiferalis化学感受过程中的生理功能,为以OBPs蛋白为防治靶标的桃蛀螟绿色防控提供理论依据。【方法】基于前期桃蛀螟触角转录组测序数据,利用PCR技术从桃蛀螟触角中获得桃蛀螟气味结合蛋白基因CpunOBP3和CpunOBP4的cDNA序列,采用生物信息学软件分析其核苷酸和氨基酸序列;构建重组表达载体pET-30a/CpunOBP3和pET-30a/CpunOBP4,原核表达并纯化获得重组目的蛋白CpunOBP3和CpunOBP4;最后利用荧光竞争结合实验测定了重组蛋白CpunOBP3和CpunOBP4对24种配体的结合能力。【结果】克隆获得桃蛀螟气味结合蛋白基因CpunOBP3(GenBank登录号: GEDO010000010.1),开放阅读框全长387 bp,编码128个氨基酸,预测分子量大小为14.72 kD;CpunOBP4(GenBank登录号: GEDO010000011.1)开放阅读框全长438 bp,编码145个氨基酸,去除信号肽的CpunOBP4蛋白预测分子量大小为12.82 kD。CpunOBP3和CpunOBP4均具有OBPs的典型特征,即含有6个保守的半胱氨酸残基。CpunOBP3和CpunOBP4重组蛋白均以包涵体形式存在。荧光竞争结合实验发现,CpunOBP3重组蛋白能与测试的7种植物挥发物有效结合,尤其与3-蒈烯的结合能力最强,解离常数Ki值为10.33 μmol/L,但不能与测试的2种桃蛀螟性信息素有效结合;而CpunOBP4重组蛋白既可以与测试的2种性信息素(顺-10-十六碳烯醛和十六醛)结合(解离常数Ki值分别为14.65 μmol/L和7.83 μmol/L),又可以与测试的8种植物挥发物有效结合,尤其与丁酸乙酯的结合能力最强,解离常数Ki值为4.32 μmol/L。【结论】根据这些结果,我们推测CpunOBP3主要在桃蛀螟寄主定位与寄主转移过程中发挥重要作用,而CpunOBP4在桃蛀螟识别性信息素和寄主植物挥发物过程中发挥双重作用。研究结果为利用干扰桃蛀螟嗅觉感受从而调控其发生与危害提供了理论依据。 相似文献
9.
【目的】本研究旨在通过克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase)基因SfTPS,分析其在草地贪夜蛾不同发育阶段、不同组织中的表达水平及不同温度胁迫时5龄幼虫中的相对表达量,为进一步探究TPS在草地贪夜蛾生长发育及抗逆应激反应中的功能奠定基础。【方法】运用RT-PCR技术克隆草地贪夜蛾SfTPS的全长编码区,并进行生物信息学分析。运用RT-qPCR技术检测SfTPS在草地贪夜蛾不同发育阶段(卵、1-6龄幼虫、蛹和成虫)、5龄幼虫不同组织(体壁、中肠和脂肪体)中和经短期(2, 4和8 h)高(35℃)低温(10℃)胁迫后5龄幼虫中的表达变化。【结果】克隆获得2 571 bp的草地贪夜蛾TPS cDNA序列,命名为SfTPS(GenBank登录号: MT920672),全长开放阅读框(ORF)长2 481 bp,编码的826个氨基酸具有TPS和TPP两个保守结构域。同源比对和系统进化分析表明,昆虫TPS蛋白具有较高的保守性,SfTPS与斜纹夜蛾S. litura的TPS亲缘关系最近,序列一致性达到99.15%。SfTPS中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲占比分别为38.14%, 12.23%和48.55%;SfTPS的三级结构为同源二聚体。RT-qPCR结果表明,SfTPS在草地贪夜蛾卵期和1-5龄幼虫期低表达,在6龄幼虫期、蛹期和成虫期高表达,且草地贪夜蛾变态前后SfTPS的表达量变化较大。组织分布结果显示,SfTPS在5龄幼虫脂肪体中表达量最高。草地贪夜蛾5龄幼虫经2~8 h低温(10℃)和高温(35℃)胁迫后,SfTPS的相对表达量显著高于对照(25℃),分别为对照的4.43~9.34和2.50~6.03倍。【结论】SfTPS基因在草地贪夜蛾生长发育过程及抵御高低温度胁迫中可能具有重要作用。 相似文献
10.
【目的】基于沟眶象属Eucryptorrhynchus两近缘种沟眶象E. scrobiculatus和臭椿沟眶象E. brandti不同虫态的转录组数据进行气味受体(odorant receptor, OR)基因的鉴定及表达特征分析,补充两种象甲的气味受体信息,为之后的功能研究提供理论依据。【方法】从沟眶象(幼虫、蛹和成虫)和臭椿沟眶象(卵、幼虫、蛹和成虫)不同虫态转录组数据库中筛选OR基因序列;基于两种象甲触角转录组数据,对两种象甲筛选得到的ORs进行种间和种内的序列比对;利用最大似然法对两种象甲新鉴定的ORs进行系统发育分析;根据两种象甲不同虫态转录组数据中OR基因的FPKM(fragments per kilobase per million mapped fragments)值对新鉴定的OR基因进行表达丰度分析;利用qPCR检测新鉴定的OR基因在沟眶象和臭椿沟眶象不同发育阶段和成虫不同组织中的表达谱。【结果】从沟眶象和臭椿沟眶象不同虫态转录组数据库中分别鉴定出6和4个OR基因,都具有完整的开放阅读框。根据与触角转录组数据的序列比对结果,从沟眶象和臭椿沟眶象分别新鉴定出4个(EscrOR50-53)和2个(EbraOR46-47)OR基因;在两象甲种间发现了一对可能的同源基因EscrOR53和EbraOR45。系统发育树显示,6个新鉴定的OR蛋白分属于鞘翅目OR亚家族2B和7。结合不同虫态转录组的FPKM数据及qPCR检测的时空表达谱得知,沟眶象3个和臭椿沟眶象2个新鉴定到的OR基因均在成虫的非嗅觉组织中高表达,且在卵、幼虫或蛹期也有表达。【结论】本研究明确了沟眶象和臭椿沟眶象不同虫态转录组中的气味受体基因及其时空表达谱,并且发现两种象甲的生殖器官中可能存在非嗅觉的功能性的ORs,提示其可能在发育的早期阶段就已发挥功能。 相似文献