文蛤过氧化氢酶的生物信息学分析

基于NCBI数据库,对文蛤过氧化氢酶基因(MmeCAT)进行生物信息学分析,旨在为文蛤过氧化氢酶的结构与功能的研究提供理论基础。结果表明,该基因编码511个氨基酸。文蛤过氧化氢酶分子量为58 181.29 Da,分子式为C_(2588)H_(3928)O_(767)N_(730)S_(20),理论等电点为8.05,属亲水蛋白。带负电荷氨基酸残基数(Asp+Glu)为63个,带正电荷氨基酸残基数(Arg+Lys)为65个。假设所有半胱氨酸全部形成胱氨酸,其消光系数为63 175 mol/L,相应的吸光度为1.086;假设所有的半胱氨酸均未形成胱氨酸时,消光系数为62 800 mol/L,相应的吸光度为1.079;其半衰期为30 h,脂肪族氨基酸指数为57.28,不稳定系数为27.77(40),可知文蛤过氧化氢酶为稳定蛋白质。亚细胞定位于过氧化物酶体,存在71个磷酸化位点和51个糖基化位点,无信号肽。二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主,在物种进化上具有高度的保守性保守结构域预测表明,该基因编码蛋白可能属于典型单功能过氧化氢酶的第三分支。研究文蛤过氧化氢酶结构,能够为文蛤抗逆性品种选育提供理论基础。     

海水盐度、温度对文蛤稚贝生长及存活的影响

在实验室条件下,研究了不同盐度（19个梯度）、温度（17个梯度）对文蛤稚贝生长和存活的影响.结果表明：文蛤稚贝的适宜生存盐度在6.5～39.5,最适生存盐度在9.0～31.0,适宜生长盐度在7.3～38.7,最适生长盐度在15.0～23.0;其适宜生存温度在4.0 ℃～36.1 ℃,适宜生长温度在7.0 ℃～35.4 ℃,较适宜生长温度在17 ℃～33.5 ℃,最适生长温度在24 ℃～27 ℃.文蛤稚贝对高温度、低盐度有较强的适应性.     

不同藻类对成熟前文蛤的生长及其生化成分的影响

为了找到适于文蛤(Meretrix meretrix)暂养、育肥的藻类,通过实验观察了不同藻类对成熟前文蛤生长的影响.实验共分为5组,分别单独投喂4种单胞藻,包括海水小球藻(CMorella vulgaris)(A组)、球等边金藻(Isochrysis golbana)(B组)、青岛大扁藻(Platymonas halgolandica)(C组)和牟氏角毛藻(Chaetoceros müelleri)(D组),及混合投喂海水小球藻、球等边金藻与牟氏角毛藻(E组).结果表明,单胞藻无论是单独投喂还是混合投喂,对成熟前文蛤的壳长和体重增长没有显著影响(P>0.05),其常规生化成分如蛋白质、脂肪、总糖及各种脂肪酸含量在某些实验组之间存在显著性差异(P<0.05).E组蛋白质含量(63.57%)最低,与其他组之间存在显著性差异;E组脂肪含量(8.17%)除低于D组(8.64%)外,高于其他3组,但与其他组间无显著性差异;E组总糖含量(7.08%)除低于C组(7.62%)外,高于其他3组,与其他组之间存在显著性差异(P<0.05).亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)和花生四烯酸(C20:4)均为C组最高,含量分别为2.06%、2.28%和6.50%,与其他组之间存在显著性差异.EPA以D组为最高(8.51%),DHA以B组为最高(10.33%).     

引起文蛤暴发性死亡病原菌的分离和鉴定

本文从江苏吕泗文蛤养殖区发病文蛤和养殖水体中分离到5株优势菌(病蛤中分离到3株优势菌, 养殖水体中分离到2株优势菌), 人工感染实验结果显示, 菌株WG1702能引起供试文蛤发病, 死亡率为100%, 且发病症状与原发病症状相同, 提示该菌是引起文蛤大面积死亡的主要致病菌, 对其形态、生理生化特征、分类地位及致病性进行了初步研究, 菌株WG1702为革兰氏阴性菌, 直杆状, 生理生化指标为：赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、硝酸盐还原、甘露糖、氧化酶、甲基红阳性, 精氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、水杨素、V.P阴性。为确定该致病菌的分类学地位, 进行了16S rRNA分子鉴定, PCR扩增获得了大小约1.5 kb的16S rRNA部分基因片段, 对其序列进行了测定, 并进行同源性分析和系统进化树构建。结果表明, 该菌株与哈氏弧菌(DQ146937)同源性最高, 为97.4%, 结合形态、生理生化鉴定结果, 最后鉴定菌株WG1702为哈氏弧菌(Vibrio.harveyi)。     

海洋酸化条件下Cd2+和Hg2+对斧文蛤幼贝急性毒性效应

为研究在海洋酸化条件下重金属污染物对滩涂贝类的影响,采用半静态急性毒性实验的研究方法,利用海洋酸化人工模拟系统,分析了不同酸化条件下(对照组pH 8.20、酸化组pH分别为7.80、7.60和7.40)Cd2+和Hg2+对斧文蛤(Meretrix lamarckii)幼贝急性毒性效应的影响。实验结果表明:在实验设定的海洋酸化范围内,单一的海洋酸化对斧文蛤幼贝的存活没有显著性影响,但海洋酸化显著增强了Cd2+和Hg2+的急性毒性。与对照组相比,酸化组Cd2+和Hg2+的毒性随着酸化程度的加剧而呈现出逐渐增强的趋势; Cd2+和Hg2+均在pH 7.40时对斧文蛤的毒性最强,其96h半致死(96h LC50)浓度分别为4.068 mg/L(Cd2+)和10.332 mg/L(Hg2+),明显低于pH 8.20、7.80和7.60时其对斧文蛤幼贝的96h LC50浓度(其值分别为Cd2+ 6.458、5.947、4.728 mg/L和Hg2+ 12.027、11.169、10.595 mg/L)。研究有助于丰富海洋酸化与重金属毒理作用在海洋贝类中的研究内容,为斧文蛤资源恢复和海洋环境保护提供科学依据。     

斧文蛤金属硫蛋白基因的克隆与表达分析

金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质,参与机体重金属解毒、维持金属元素代谢平衡以及清除自由基等生理功能。为了解斧文蛤金属硫蛋白（Ml-MT）的分子生物学特征及其在重金属Cd2+胁迫下的响应机制,本文采用RACE技术从斧文蛤（Meretrix lamarckii）总RNA反转录产物中获得了636 bp的Ml-MT cDNA基因序列。该序列包含65 bp的5非编码区（UTR）和340 bp的3非编码区（UTR）以及231 bp的开放阅读框（ORF）,可编码76个氨基酸;其中半胱氨酸占27%,不含芳香族氨基酸,含16个MT所特有的Cys-Xn-Cys结构,预测的分子量约为7.704 kD,理论等电点7.138。MT氨基酸序列比对分析表明:斧文蛤金属硫蛋白（Ml-MT）与丽文蛤（Meretrix lusoria）的相似性高达88%,与文蛤（Meretrix meretrix）的同源性为87%。实时荧光定量（qRT-PCR）检测MT在斧文蛤5种组织中均有表达,但存在组织特异性,其中内脏团表达量最高,其次依次为鳃丝、闭壳肌、外套膜、斧足。在Cd2+（0.13 mg/L）胁迫0、6h、12h、24h、48h、72h和96h下,斧文蛤内脏团MT呈现出不同程度的上调表达,具体表现为高-低-高-低的波浪式变化,除6h以外,其他时间点均与对照组存在极显著差异（P0.01）。本研究表明:MT基因在维护机体正常生理功能及斧文蛤抵御重金属Cd2+胁迫过程中发挥着重要的分子调控作用。     

文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆与序列分析

文蛤(Meretrix meretrix)是我国重要的滩涂养殖贝类之一,由于病害等原因,特别是红肉病的蔓延,文蛤增养殖业的发展受到严重制约。铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是活性氧清除酶系中最重要的酶,在生物体内参与清除氧自由基,防御分子损伤和机体衰老等诸多生物事件。通过构建SMART全长cDNA文库和RACE的方法,克隆得到了文蛤胞内Cu/Zn-SOD(icCu/Zn-SOD)的全长cDNA序列。生物学软件分析表明,该序列全长为1383bp,5′UTR为45bp,3′UTR为876bp,开放阅读框长度为462bp,编码153个氨基酸,Cu原子分别与His46、His48、His63、His119配位,Zn则与His63、His71、His80和Asp83配位,半胱氨酸Cys57和Cys145之间形成唯一的链内二硫键。蛋白质结构中心是由8条反向平行的β折叠围成的圆桶状结构。文蛤icCu/Zn-SOD与紫贻贝等其它9种海洋贝类的Cu/Zn-SOD具有较高的同源性。     

超声波提取文蛤中氨基酸的工艺

采用正交试验法探讨超声波提取文蛤中氨基酸的最佳工艺条件,用高效液相色谱法测验提取液中氨基酸各组分的含量,用原子吸收光谱法测微量元素及重金属。结果表明:提取的最佳工艺条件是料剂比200g·L-1,60℃,中等强度的超声波处理10min。与未处理比较,氨基酸总量提高,蛋白质含量微增,铜、铅、铬含量增多,铁、汞含量降低,锰含量不变。     

文蛤“万里”新品种(系)生长性能养殖比较研究

于2016年5月10日至2016年11月10日,在连云港浅海底播和池塘养殖环境下比较研究了文蛤"万里红"、"万里1号"、"万里2号"3个品种(系)商品贝养殖生长性能。6个试验组分别为池养万里红(CW)、池养万里1号(CW_1)、池养万里2号(CW_2)、底播万里红(DW)、底播万里1号(DW_1)、底播万里2号(DW_2)。结果显示:幼贝经60 d养殖,CW_2组壳长显著大于CW、CW_1、DW和DW_1组(p0.05);壳高和体重显著大于其余各试验组(p0.05);壳宽显著大于CW、CW_1、DW和DW_2组(p0.05)。幼贝经120 d养殖,CW、CW_1和CW_2组壳长显著大于DW、DW_1和DW_2(p0.05);CW和CW_2壳高显著大于CW_1,DW、DW_1和DW_2(p0.05);CW和CW_2壳宽均显著大于CW_1和DW (p0.05);CW体重显著大于CW_1(p0.05)。幼贝经180 d养殖,DW_1和DW_2组壳长显著小于其余各试验组(p0.05);CW、CW_1和CW_2在壳高、壳宽和体重指标上显著大于DW、DW_1和DW_2(p0.05)。以上研究表明,文蛤幼贝养成商品贝,"万里"3个新品种(系)在连云港本地池塘养殖优于海区底播养殖;在池塘养殖模式中,前期"万里2号"具有生长优势,中后期"万里"3个品种(系)末体重基本相同,无显著性差异。     

文蛤Smad1/5基因克隆、时空表达及生长相关SNP位点筛查

为探讨Smad1/5基因在贝类生长发育中的调控作用, 利用RACE技术克隆获得文蛤Smad1/5(Mm-Smad1/5)基因的cDNA全长序列, 对其生物信息学、不同组织和不同发育时期时空表达特征进行分析, 并利用直接测序法分析了外显子区域SNP位点与生长性状的相关性。结果表明: Mm-Smad1/5的cDNA全长序列为1832 bp, 开放阅读框1380 bp, 编码459个氨基酸; 氨基酸多序列比对显示, Mm-Smad1/5蛋白与太平洋牡蛎Smad5、大西洋舟螺Smad1的一致性分别为83.7%和80.2%, 与人、鸡、非洲爪蟾等脊椎动物Smad1、Smad5氨基酸序列的一致性达到70.5%以上, 说明该基因具有较高的保守性; 结构域预测发现, Mm-Smad1/5含有Smads蛋白家族特有MH1、MH2两个高度保守结构域。荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明, Mm-Smad1/5基因在成体6个组织均有表达, 尤其在斧足、外套膜中表达量显著高于其他组织(P<0.05);Mm-Smad1/5基因在各发育时期广泛表达, 从原肠胚期开始大量表达, 一直持续到壳顶幼虫期, 而从眼点幼虫大量下降, 稚贝时期又有所上升。Mm-Smad1/5基因外显子区域SNP位点相关分析表明, 共发现了9个SNP位点, 其中936 G>T位点与文蛤的生长性状显著相关(P<0.05)。Mm-Smad1/5基因在文蛤生长发育中发挥重要调控作用, 可作为高产良种选育的候选基因, 而生长关联SNP位点分析将为文蛤分子标记辅助育种研究奠定重要基础。