表皮生长因子受体基因突变检测方法改进及初步临床验证

目的:改进现有的检测表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的荧光PCR法并开发出新的试剂盒,将其与直接测序法和ARMS法进行对比,验证该试剂盒用于临床诊断的敏感性、特异性和准确性。方法:收集2013年6月至2015年8月手术确诊的141例非小细胞肺癌(NSCLC)的石蜡包埋组织标本。采用盲法分别使用直接测序法、ARMS法和新试剂盒检测EGFR突变,比较新试剂盒与其他两种检测方法的差异,结果不一致时采用三种方法分别重复检验一次。结果:三种方法检测成功率均为100%,新试剂盒与直接测序法测得结果完全一致的比率达75.9%(107/141),在直接测序法测得的96例突变阳性中,92例在新试剂盒检测中得到验证(95.8%)。而直接测序法显示突变阴性的45例中,新试剂盒检测发现了23例突变阳性,两种检测方法的结果存在统计学差异(x2=40.745,P0.05)。与直接测序法进行比较,新试剂盒检测EGFR突变的敏感性、特异性分别为95.8%、48.9%,阳性预测值、阴性预测值分别为80.0%、84.6%,检测准确度为80.9%。以ARMS检测法为金标准,新试剂盒测得结果完全一致的比率达84.4%(119/141),两者的一致性比较好(K=0.749,P0.05),敏感性、特异性分别为94.1%、86.4%。结论:改进后EGFR基因突变检测的试剂盒在技术上较好地控制了检测结果的假阳性和假阴性,该检测方法较直接测序法具有更好的敏感性和准确性,与现有的ARMS法一致性较高。     

阴部神经痛的解剖学基础及治疗进展

阴部神经痛是发生于会阴部阴部神经支配区域的烧灼样,电击样,针刺样疼痛,是典型的神经病理性疼痛,其目前的患病率尚未准确统计、诊断和治疗均比较困难,患者长期遭受精神和身体上的双重折磨、生活质量低下。阴部神经常与阴部血管伴行共同走行于阴部神经管内,可分为三个主要的分支,即直肠下神经,会阴神经和阴茎/阴蒂背神经。不同分支病变将会导致不同部位的疼痛。其治疗方法目前主要包括保守治疗、阴部神经阻滞、阴部神经外科减压以及神经调控。本文就阴部神经解剖结构,阴部神经痛病因和临床表现,诊断及其治疗进展做一简要综述。     

双侧股神经阻滞用于双膝关节置换术患者的麻醉效果和对血清炎性因子水平的影响

目的:研究双侧股神经阻滞术用于双膝关节置换术患者麻醉效果和对患者血清炎性因子水平的影响。方法:选择2015年10月～2018年10月在我院进行双膝关节置换术的110例患者,按照其入院顺序经随机数字表法分为两组,每组55例。对照组采用全身麻醉,研究组采用双侧股神经阻滞联合全身麻醉。比较两组的麻醉情况,治疗前后血清炎性因子白介素6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)、舒张压(DBP)、收缩压(SBP)、心率(HR)水平的变化。结果:两组麻醉时间比较差异无统计学意义(P0.05);研究组拔管、恢复室停留和苏醒时间均显著短于对照组(P0.05)。两组术后24 h、48 h血清炎性因子IL-6、CRP水平均高于术前,但研究组以上指标均显著低于对照组(P0.05);两组术中DBP、SBP、HR水平均较术前显著降低(P0.05),但研究组DBP、SBP、HR水平均显著高于对照组(P0.05),两组术后DBP、SBP、HR水平比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论:与单纯采用全身麻醉相比,双侧股神经阻滞可有效改善双膝关节置换术患者的麻醉效果,并降低其血清炎症因子和稳定其血流动力学。     

miR-34c逆转乳腺癌耐药细胞株MCF-7/DOX耐药性的研究

miR-34在肿瘤发生发展中起着至关重要的作用,然而,mi R-34在肿瘤耐药中的作用研究不多。该研究将合成的mi R-34c成熟序列转染乳腺癌阿霉素(doxorubicin,DOX)耐药细胞MCF-7/DOX,探讨mi R-34c体外逆转MCF-7/DOX细胞耐药性作用及其可能的机制。采用Real-time RT-PCR检测mi R-34c在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/DOX中的表达,MTS法检测miR-34c对MCF-7/DOX细胞阿霉素耐药性的影响,流式细胞术检测miR-34c对MCF-7/DOX细胞周期和凋亡的影响,Real-time RT-PCR和Western blot法检测多药耐药相关蛋白MDR、MRP以及细胞周期与凋亡相关蛋白Bcl-2、E2F3的表达。结果显示,mi R-34c在乳腺癌MCF-7/DOX耐药细胞中低表达,转染mi R-34c可明显增加耐药细胞对阿霉素的敏感性;流式分析发现,miR-34c可以促进耐药细胞G2期细胞周期阻滞和凋亡;与对照组相比较,miR-34c转染组细胞MDR、MRP蛋白表达无明显变化,而Bcl-2、E2F3 mRNA和蛋白表达均明显下调。研究表明,miR-34c直接靶向抑制Bcl-2和E2F3的表达,诱导细胞周期G2期阻滞和凋亡,进而增强MCF-7/DOX耐药细胞对阿霉素的敏感性。     

氟康唑对热带念珠菌活性氧和线粒体膜电位的影响

为了探讨氟康唑作用机制,观察它对热带念珠菌作用后存活率、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,△Ψm)和细胞周期的变化。参照NCCLS M27-A方案的微量稀释法测定氟康唑对热带念珠菌的最低抑菌浓度(MIC);热带念珠菌与不同浓度氟康唑共同培养后用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)分析热带念珠菌存活率、ROS、线粒体膜电位△Ψm和细胞周期的变化。结果表明,氟康唑作用后,热带念珠菌氟康唑耐药株的存活率、ROS、线粒体膜电位△Ψm和细胞周期各期比例均没有明显变化;而热带念珠菌氟康唑敏感株的存活率和线粒体膜电位△Ψm明显下降,ROS明显升高,而且大部分热带念珠菌阻滞于G2/M期,并出现明显凋亡峰,呈一定的时间剂量依赖关系。自由基清除剂谷胱甘肽抑制热带念珠菌ROS的产生,阻止细胞周期G2/M期阻滞和降低凋亡。由此可见,氟康唑可能通过刺激热带念珠菌产生过多ROS,并使线粒体膜电位△Ψm下降,从而诱导热带念珠菌凋亡。     

瑞芬太尼辅助颈丛神经阻滞用于甲状腺手术麻醉70例观察

目的探讨瑞芬太尼辅助颈丛神经阻滞用于甲状腺手术麻醉的可行性及效果。方法选择70例甲状腺肿大在Ⅱ°以内,既往无明显心、肺疾患的甲状腺手术患者,行双侧颈丛神经阻滞,术中持续输注小剂量瑞芬太尼,以0.05μg.kg-1.min-1为基础剂量,并根据病人的反应增减剂量,最大不超过0.1μg.kg-1.min-1。观察术中患者血压、心率、脉搏氧饱和度的变化,评价术中疼痛及呼吸抑制、肌强直等不良反应的情况。结果所有病例术中血压、心率、脉搏氧饱和度均保持平稳,镇痛效果优53例,良17例;其中2例有轻度呼吸抑制（SpO2〈92%）,经停药、给氧处理后迅速恢复正常,其余患者麻醉过程SpO2保持在95%以上。所有患者均无肌强直等不良反应发生。结论术中注意加强呼吸管理,常规面罩吸氧,小剂量瑞芬太尼辅助颈丛神经阻滞麻醉下行甲状腺手术是安全、有效的。     

DEK蛋白的真核表达纯化及其活性检测

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达DEK蛋白并进行纯化。首先以pFastBacI质粒构建重组质粒pFastBacI-DEK,转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-DEK,通过脂质体介导转染Sf9细胞产生具有强感染力的重组杆状病毒AcNPV-DEK。用此重组杆状病毒AcNPV-DEK感染Sf9细胞表达His-DEK融合蛋白。在非变性条件下,利用Ni-NTA agarose对表达的His-DEK融合蛋白进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting分析,在50 kDa处出现特异性蛋白条带并证实其为His-DEK融合蛋白。凝胶迁移阻滞实验表明,融合蛋白His-DEK与DNA 的结合具有结构特异性,其与超螺旋型DNA结合活性强于与线性化DNA的结合活性。真核表达并纯化的融合蛋白His-DEK与DNA的结合活性要明显强于原核表达的融合蛋白His-CDB。DEK 蛋白的磷酸化修饰会阻碍其与DNA的结合,而Sf9细胞中表达的融合蛋白His-DEK存在磷酸化修饰,将His-DEK去磷酸化后,其与DNA的结合活性有所提高。     

铜绿假单胞菌cntRLMN操纵子介导锌离子摄取的功能鉴定

【目的】本研究以铜绿假单胞菌PAO1 (Pseudomonas aeruginosa PAO1,菌种编号ATCC15692)为对象,研究cntRLMN在锌离子摄取中的功能。【方法】在ΔznuBC的基础上,以同源重组的方法构建了cntRLMN的各种突变菌株,通过质粒接合转移的方法构建其互补菌株及lacZ转录融合报告菌株,运用β-半乳糖苷酶酶活检测研究了Zur蛋白对cntRLMN的转录调控,凝胶阻滞实验(EMSA)检验Zur蛋白与cnt启动子及cnt启动子的突变片段的体外结合,并进一步通过生长曲线分析对cntRLMN中cntR、cntL、cntN等基因的锌离子摄取功能进行了分析和鉴定。最终,通过构建大蜡螟幼虫的侵染模型来研究cntRLMN对铜绿假单胞菌毒力发挥的影响。【结果】lacZ转录融合的酶活分析显示cntRLMN受Zur蛋白的负调控,其表达以Zur蛋白依赖的方式受锌离子饥饿的诱导;EMSA实验的结果显示cntRLMN的启动子可以与His-Zur结合形成DNA-蛋白质复合体,结合位点为GCGTTATAGTATATCAT;生长曲线和大蜡螟幼虫侵染实验的分析结果显示ZnuBC和CntRLMN的功能存在互补性,仅znuBC和cntRLMN双缺失突变时菌株在限锌培养条件下的生长和对大蜡螟幼虫的毒性才受到显著抑制,说明CntRLMN代表另一种独立的锌离子摄取系统。【结论】cntRLMN是受Zur直接负调控的另一种独立的铜绿假单胞菌锌离子摄取系统,对铜绿假单胞菌毒力的发挥起重要作用。     

人胃癌BGC-823细胞中去甲斑蝥素抑癌作用机理的蛋白质组学研究

去甲斑蝥素是我国自行研制的抗肿瘤药物,在临床上主要用于消化道肿瘤的治疗．实验表明,去甲斑蝥素可引起人胃癌BGC-823细胞发生 M期阻滞及细胞凋亡．进一步利用双向电泳和质谱技术,筛选出了去甲斑蝥素抑癌作用相关蛋白．研究显示,线粒体热休克蛋白CH60、线粒体ATP合酶d亚单位、内质网葡萄糖调节蛋白GRP78、线粒体Hsp70的辅助因子GRPE1、SH3L3以及染色质组装因子1小亚基RBBP4参与了去甲斑蝥素的抑癌作用．研究提示,去甲斑蝥素可能通过促进线粒体热休克蛋白及p53的表达进而激活caspase-3依赖的凋亡通路,并且去甲斑蝥素在引发内质网协迫之后,可通过抑制胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)的活性促进肿瘤细胞的凋亡．进一步分析了去甲斑蝥素与线粒体ATP合酶抑制剂寡霉素A的联合用药对人胃癌细胞生长的影响,结果表明,联合用药的抑瘤效果比单独用药的抑瘤效果显著,提示去甲斑蝥素可能通过抑制线粒体ATP合酶功能抑制BGC-823生长．上述结果为优化去甲斑蝥素的联合用药方案提供了新线索．