利用rpoB基因芯片技术进行快速分枝杆菌菌种鉴定

利用rpoB基因芯片技术快速进行分枝杆菌菌种鉴定。以分枝杆菌rpoB基因编码序列为靶基因, 用基因芯片技术检测21种分枝杆菌标准株；8种其它细菌标准株；126株临床分离株。分枝杆菌与其它细菌标准株经PCR扩增后, 分枝杆菌标准株均扩增出360 bp DNA片段, 在其它细菌中, 除甲型溶血性链球菌和假白喉棒状杆菌出现同样片段外, 其它细菌均未见扩增。21种寡核苷酸探针除海分枝杆菌与偶然分枝杆菌的探针有交叉杂交外, 其余均为特异性杂交。对126株临床分离株进行鉴定, 89株为结核分枝杆菌, 占70.6％(89/126), 非结核分枝杆菌(NTM)占9.2％(9/98)。应用rpoB基因芯片技术鉴定分枝杆菌菌种, 是一种快速、准确的方法, 具有较高的临床应用价值。     

ETA基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测铜绿假单胞菌的研究

铜绿假单胞菌是临床上常见致病菌, 传统的检测方法有各种弊端。本研究对该细菌的ETA基因用生物信息学方法加以分析, 选取相对保守且高度特异的DNA序列, 设计一对特异性引物和一个TaqMan探针, 建立FQ-PCR (fluorescence quantitative PCR)检测PA的方法。通过对梯度浓度的铜绿假单胞菌基因组DNA样品进行FQ-PCR检测和对多种细菌的DNA进行扩增, 来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。试验结果表明, 对比现有的检测方法, 以ETA基因为靶基因, 基于TaqMan探针的快速FQ-PCR检测技术有更高的灵敏度和更好的特异性等优点, 具有很好的研究价值和应用前景。     

toxR基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测副溶血弧菌

以toxR基因为靶基因,通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧茵的TaqMan实时荧光PCR方法.特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧茵,而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原茵没有交叉反应:灵敏度试验表明,该方法最少可检测到25个拷贝的toxR基因重组质粒,对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为21 cfu/mL和210 cfu/g;重复性试验表明,同一样品于试验内及试验间的变异系数分别为0.9%和1.3%:所制作的标准曲线在2.5 × 101～2.5 × 106拷贝数之间有较好的线性关系,能对副溶血孤菌进行准确的定量分析.结果表明,本研究所建立的副溶血弧菌实时荧光PCR检测方法具有特异性好,灵敏度高、重复性好的特点,能进行定量检测,而且检测时间从核酸抽提到出实验结果仅需要3 h.是快速检测副溶血弧菌的有效手段.     

模拟穿透雨减少对锐齿栎(Quercus aliena var. acuteserrata)树干液流密度的影响

降水格局变化是全球气候变化的重要特征之一,未来气候变化下,较为频繁和严峻的干旱将威胁地球中纬度部分地区的森林,但森林植被如何响应季节性干旱胁迫及其机制尚不清楚。北亚热带-暖温带过渡区分布着以锐齿栎(Quercus aliena var.acuteserrata)为优势树种的落叶阔叶林,研究其水分蒸腾代谢过程对干旱的响应是评估气候变化对过渡区天然落叶阔叶林生态系统水碳影响的关键科学问题。在典型的锐齿栎天然林中通过开展模拟穿透雨减少大型野外实验,采用Granier热扩散式探针技术监测锐齿栎树干液流密度的动态变化,研究了不同径级锐齿栎树干液流密度对模拟干旱的响应规律。结果表明:(1)穿透雨减少对树干液流密度的影响呈现季节变异。在7月份,林内穿透雨减少显著降低了锐齿栎的树干液流密度,但生长季后期的10月份林内穿透雨减少反而使锐齿栎树干液流密度显著升高。(2)不同径级的锐齿栎树干液流密度在生长季内对干旱有不同的响应,特别是小径级的树干液流密度与其他径级有较多的不同。小径级的锐齿栎树干液流密度在5、7月份表现为减雨样地显著小于对照样地,在9、10月份则表现为减雨样地显著大于对照样地。中径级的锐齿栎树干液流密度在5、10月份表现为减雨样地显著大于对照样地,在7月份则表现为减雨样地极显著小于对照样地。大径级的锐齿栎树干液流密度在6、7月份表现为减雨样地显著小于对照样地,在10月份则表现为减雨样地显著大于对照样地。     

Takayama pulchellum原位增长率测定的研究

现今用于测定有害藻华生物原位增长率的方法很难在现场进行有效地应用,因此我们尝试采用基于rRNA、叶绿素和总蛋白质浓度的定量测定方法来估算其细胞增长率.本研究重点对Takayama pulchellum细胞株(TPXM)的rRNA含量和特定生长率的关系进行了探索.用荧光标记的肽核酸探针结合全细胞杂交方法,结合流式细胞仪和专业图像分析软件对T.pulchellum单细胞水平的rRNA进行了定量检测.结果表明不同生长阶段的T.pulchellum单细胞rRNA水平与其相应的细胞特定生长率有较好的相关关系(R2=0.7293,p＜0.01,n=14),单细胞蛋白质含量、rRNA水平与同步后的细胞周期变化情况也有较好的相关关系(R2＝0.6984,p＜0.01,n=14).上述结果提示单细胞rRNA含量可作为指示细胞周期变化和细胞特定生长率的较好指标.     

大鼠Y染色体探针的制备与鉴定

目的:研究制备地高辛标记的大鼠性别决定基因Y区(Y染色体,SRY)探针,用于检测雄性大鼠来源的细胞在雌性受鼠体内的SRY基因表达情况.方法:按已知的雄性大鼠Y染色体上性别决定基因(SRY)的序列,请上海博亚公司合成oligoDNA,采用PCR技术连接并扩增,地高辛标记的方法制备基因探针.以雌性大鼠为对照,原位杂交法检测大鼠肾组织切片Y染色体阳性细胞情况.结果:用原位杂交法证实在雄性大鼠肾脏内有SRY表达,而雌性大鼠肾脏无Y染色体阳性细胞,证实这种探针具有较高的敏感性和特异性.结论:大鼠性别决定基因SRY探针的制备成功,为进一步研究异体雄性大鼠细胞移植后的分布和表达提供了实验基础.     

荧光定量PCR

荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确，荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。也许作为确认微阵列数据的金标准，TaqMan有些名不副实。TaqMan与SYBR Green孰优孰劣？在选择实验方案时要根据实验目的，以及对数据精度的要求来决定。