蛙病毒同源蛋白RGV-27R和ADRV-85L的表达及其免疫原性分析

沼泽绿牛蛙病毒(Rana grylio virus,RGV)和大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus,ADRV)同属虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)成员,是引起水产动物高死亡率的病原。其同源早期蛋白RGV-27R和ADRV-85L与蛙病毒代表株蛙病毒3型(Frog virus 3,FV3)25R基因所编码的大小为31kD的早期蛋白P31K(FV3-P31K)同一性超过99%。我们在观察和比较RGV与ADRV感染大鲵胸腺细胞(Giant salamander thymus cell,GSTC)显微病变的基础上,将ADRV-85L和RGV-27R基因分别克隆到原核表达载体pET-32a与pMAL-p5X中,转化宿主菌E·coli BL21(DE3)并诱导表达,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测,对这两种蛋白的原核表达及其产物免疫原性进行分析。结果显示这两种基因在载体pET-32a中的表达效率要显著高于pMAL-p5X。随后,取高效诱导表达的pET-32a-RGV-27R产物,经Ni-NTA His-Bind亲和层析分离提纯,获得浓度为1.2 mg/mL的融合蛋白His-RGV-27R,用其免疫动物,制备了抗体27R-Ab,酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗体的效价为1∶6.25×10~6。用经正常大肠杆菌菌液和正常GSTC细胞悬液吸附处理后的抗体作为一抗,对被RGV或ADRV感染的GSTC细胞悬液进行Western Blot检测,并以重组原核质粒表达的融合蛋白His-RGV-27R和HisADRV-85L作为阳性对照,以正常GSTC细胞悬液为阴性对照,分别从RGV或ADRV感染的GSTC细胞悬液中,检出大小同为31kD的特异性蛋白条带。本研究证实两种蛙病毒同源早期蛋白RGV-27R和ADRV-85L不仅都能在两栖动物细胞中表达,且具有相同的抗原特性,这为深入研究这类病毒蛋白对蛙病毒复制的影响及其与宿主相互作用的分子机制提供了实验材料。     

中国无尾两栖类新记录种——朝鲜侧褶蛙北大核心CSCD

2021年9月在沈阳市蒲河湿地公园(41°41′54″N,122°52′19″E,海拔35 m)采集到3号无尾两栖类动物,经形态特征比较确认为侧褶蛙属(Pelophylax)金线侧褶蛙种组(P.plancyi species complex)的物种。基于线粒体12S rRNA和16S rRNA基因联合构建的侧褶蛙属部分物种最大似然系统发育树显示,采集到的侧褶蛙标本与朝鲜侧褶蛙(P.chosenicus)聚为一支,且具有较高的支持率(0.95)。综合形态和系统发育比较,确定采集到的标本为无尾目(Anura)蛙科(Ranidae)侧褶蛙属的朝鲜侧褶蛙,系中国两栖动物分布新记录种。     

桉树枝瘿姬小蜂胚胎发育及胚后发育

【目的】对桉属树木的重要害虫桉树枝瘿姬小蜂Leptocybe invasa胚胎发育及胚后发育生物学特征进行详细调查,以期深入了解该害虫的生物学特征及发生为害规律。【方法】对桉树枝瘿姬小蜂雌性生殖系统、卵、虫瘿进行解剖,观察其胚胎发育和胚后发育过程,测量其各发育阶段的虫瘿、虫室和幼体的体积及薄壁细胞层的厚度。【结果】桉树枝瘿姬小蜂完成胚胎发育约需138 h,由3个阶段组成：产卵后0-24 h为营养物质聚集期;36-84 h为胚胎期;96-138 h为孵化期。桉树枝瘿姬小蜂在虫瘿内完成发育,其发育过程与虫瘿发育过程保持一致。虫瘿结构由3个基本层组成,由外至内分别为表皮层、中间层和薄壁细胞层。桉树枝瘿姬小蜂幼虫体积增长速率随发育时间呈现单峰型,在30 d时增长速率达到最大;虫瘿体积的增长速率呈抛物线状,并且虫瘿内薄壁细胞层厚度随发育时间也呈现抛物线状,其前期增长较快,后期下降变缓。【结论】桉树枝瘿姬小蜂发育至25 d时处于取食量较小的低龄阶段,而虫瘿内薄壁细胞层(食物)厚度已达到最大,为幼虫体积快速增大阶段作好准备。     

野生棘胸蛙消化器官蛋白酶的分布及酶活力

本研究在不同p H和温度条件下以离体方式对野生棘胸蛙(Quasipaa spinosa)不同消化器官的蛋白酶活力进行了分析。结果表明,食道、胃、胰的蛋白酶活力受到酶体系p H的显著影响(P0.05),且随p H升高呈现典型的单峰型活力曲线。食道和胃的蛋白酶活力在p H为1.5时达到峰值,胰的酶活力在p H为9.6时达到峰值,而肠道酶活力在p H为7.4时达到峰值。各消化器官蛋白酶活力具有明显的温度依赖性(P0.05),酶活力随温度升高也均呈典型的单峰型活力曲线,不同消化器官的最大酶活力温度分别为,食道50℃、胃50℃、胰45℃、前肠45℃、后肠45℃、直肠45℃。在最大酶活力的p H和30℃条件下,各消化器官蛋白酶活力由高到低依次为胰、食道、胃、直肠、前肠、后肠。由此可见,蛋白酶在棘胸蛙消化系统的分布具有明确的规律性,且不同来源的蛋白酶需要在特定p H和温度下才能表现出最大的反应活性。     

大鳄龟感染蛙病毒的PCR检测及组织病理分析

2013年3月成都市某海洋馆送检2只发病大鳄龟(Macrochelys temminckii),临床特征表现为:精神状态萎靡,爬行无力,对外界刺激反应迟钝;颈部和四肢局部红肿,腹甲溃烂,严重部位甚至穿孔,最后死亡。为明确患病大鳄龟的病因,进行了细菌学、组织病理学和PCR检查。细菌学检查阴性;病理组织学观察发现,大鳄龟多组织、器官均发生严重病变,尤其是肾、肝、肺和心的损伤最为严重,表现为明显的变性、坏死和炎症细胞浸润,并在一些病变组织细胞浆内见嗜酸性或嗜碱性包涵体。针对蛙病毒(Ranavirus)病毒的特异性PCR检测扩增出蛙病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因500 bp目的片段,测序后的DNA序列与Gen Bank中已知核酸序列进行Blast比对,发现其与Gen Bank中的蛙病毒主要衣壳蛋白基因同源性达95%~99%。根据组织病理特点及PCR检测结果推测大鳄龟的死亡是感染蛙病毒所致。     

噪音环境下花臭蛙求偶鸣声特征分析

2012年7月份,在黄山浮溪地区利用超声录音设备录制并分析了繁殖季节雄性花臭蛙(Odorrana schmackeri)个体的求偶鸣声。观察发现花臭蛙繁殖活动主要集中在7月中旬,繁殖高峰期活动无昼夜规律,全天均可见求偶鸣叫及抱对产卵等行为,并且多在浅水滩处活动。花臭蛙鸣声根据音节数和声谱特征可分为4种类型:即单音节音、婴儿音、双音节音和多音节断奏音,其中,单音节音、双音节音和婴儿音较为常见。利用Selena软件给出4种声音的语图以及各自对应的能谱图,利用Sound Analysis pro v1.2对单音节音、双音节音和婴儿音的鸣声特征参数进行定量分析,分析的声音参数包括鸣叫持续时间、音节数、音节持续时间、音节间隔、主频、脉冲率等。结果表明,花臭蛙鸣声的主频范围为1.8~4.5 k Hz(n=65)。鸣声不包括超声组分,主频峰值(3.1±0.7)k Hz,与前人电生理实验所得花臭蛙听觉敏感峰值一致,说明花臭蛙主要在这一频段进行通讯。对3种常见鸣叫音声音参数的单因素方差分析结果表明,双音节音与单音节音和婴儿音在声音持续时间上存在显著性差异(P0.01),双音节音和单音节音在第二谐波声强上也具有显著性差异(P=0.01)。花臭蛙的双音节音在3种常见鸣叫音中具有最长的持续时间,为(99.5±8.4)ms,故推测,双音节音为花臭蛙繁殖期主要求偶鸣声,并通过其鸣声时长的变化来体现自身品质的好坏。     

寄主植物对桉树枝瘿姬小蜂生物学特性的影响

桉树枝瘿姬小蜂Leptocybe invasa Fisher&La Salle是桉属(Eucalyptus)植物的重要枝叶害虫。自2007年在我国发现以来,对广西、海南及广东地区的桉树种植已造成严重危害。本文在野外调查的基础上,研究了海南和广东地区共5种桉树上桉树枝瘿姬小蜂的虫体大小、寿命及怀卵量。结果表明,桉树品种能够显著影响桉树枝瘿姬小蜂的虫体大小;用40%蜂蜜水进行补充营养时,不同寄主植物上桉树枝瘿姬小蜂雌成虫的寿命差异显著,而桉树枝瘿姬小蜂雄虫在不同寄主间无显著性差异;不同寄主植物上桉树枝瘿姬小蜂雌成虫的怀卵量不同,并且随着日龄的延长,其怀卵量呈现上升的趋势。     

中国玛蠊属三新种记述(蜚蠊目,姬蠊科)

刺玛蠊属Margattina Bey-Bienko,1958是玛蠊属Margattea Shelford,1911新的同物异名。记述了产于中国的玛蠊属Margattea Shelford,1911的3新种并提出1新组合:华丽玛蠊M.speciosa sp.nov.,分布于湖南、江西;岔突玛蠊M.furcata sp.nov.,分布于贵州;无斑玛蠊M.immaculata sp.nov.,分布于浙江;三刺玛蠊M.trispinosa (Bey-Bienko,1958)comb.nov.,且附中国已知种的检索表。新种模式标本保存在中国科学院上海昆虫博物馆。     

泽陆蛙(Fejervarya limnocharis)两性异形的个体发育和雌体繁殖

2010年3月下旬-7月上旬于浙江富阳市农田采集680只泽陆蛙(Fejervarya limnocharis),研究了泽陆蛙成体和幼体的个体大小和局部形态特征的两性异形;通过解剖雌体获得窝卵数、测量抱对个体获得形态数据,研究了雌体大小与生育力关系以及抱对两性个体体形大小的相关性.结果表明:捕获个体中,雌性和雄性成体的最小体长分别为33mm和30 mm;雄性成体个体数显著超过雌性成体,两性幼体个体数无显著差异;两性成体头部大小、四肢长随体长呈同速增长,眼径和体重随体长呈异速增长,两性幼体所有被检形态特征均随体长呈同速增长;雌性成体平均体长显著大干雄性成体,去除体长差异的影响后发现,除眼径无显著的两性差异外,其余被检形态特征均为雌性大于雄性;幼体除雌性体重大于雄性外,其余被检形态特征均无两性差异;窝卵数与雌体大小(体长和体重)呈显著的正相关;两性抱对个体的体长无显著相关性;泽陆蛙雄性成体体形小于雌性成体的个体大小两性异形模式可能决定于驱使雄性向较大体形发展的进化驱动力相对较弱,雌性增大体形可增加繁殖输出,故向较大体形发展的进化驱动力相对较强;除体重外,其余被检形态特征的两性异形均形成于性成熟之后.     

湖北省两栖类一新纪录——大绿臭蛙

2009年8～9月及2010年7月,在湖北省宜昌市高家堰镇采集两栖类标本,其中,部分臭蛙标本被鉴定为大绿臭蛙(Odorrana graminea),属湖北省新纪录。要确定中国大绿臭蛙各居群的关系、澄清其分类问题,有必要进行适度的资源考察和深入的系统地理学研究。