P277多肽融合热休克蛋白65提高抗1型糖尿病的作用

为了提高P277肽抗1型糖尿病的作用, 把P277肽融合在卡介苗热休克蛋白65的C端, 构建了pET28a- HSP65-P277高效表达载体, 在大肠杆菌中高效可溶性表达。利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析分离纯化了融合蛋白HSP65-P277。使用HSP65-P277在没有任何佐剂存在的情况下免疫非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠, 通过三次腹腔注射, 每月收集被免疫动物的血清, 血糖浓度用自动生化分析仪测定。结果显示HSP65-P277免疫组小鼠血糖平均值及糖尿病的累积发病率和其余组相比均有显著差异(P<0.01), 融合蛋白HSP65-P277抗NOD小鼠糖尿病的作用显著高于单独的P277和HSP65。为进一步开发能用于临床的1型糖尿病疫苗提供了良好的设计思路, HSP65-P277极有可能进一步发展成为新的抗I型糖尿病的疫苗。     

抑制mTOR信号通路可增强5-aza-dC对胃癌细胞生长的抑制作用

本实验主要研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路与DNA甲基化在人胃癌细胞生存活力、细胞周期、相关基因及蛋白表达方面的相互作用．分别单独或联合DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-aza-dC）、mTOR抑制剂雷帕霉素（rapamycin，RAPA）和P13K抑制剂LY294002干预人胃癌MKN45和SGC7901细胞，以MTT检测细胞生存活力，流式细胞术检测细胞周期，real-timePCR检测PTEN，p27^Kip1基因表达情况，亚硫酸氢盐修饰后测序检测DNA甲基化改变，蛋白免疫印迹检测相关蛋白表达情况．结果发现单独应用5-aza-dC对胃癌细胞的抑制作用不明显，当其联合mTOR信号通路抑制剂时则显著抑制胃癌细胞生长（P〈0．01）；抑制mTOR信号通路可增强5-aza-dC使细胞阻滞在G2期的作用；联合用药还能提高抑癌基因PTEN,p27^Kip1的表达，但不影响DNA甲基化状态；LY294002及RAPA使Akt，p70S6K及4E-BPl磷酸化表达显著下降（P〈0．01），但5-aza-dE并不增强这一效应．以上研究提示mTOR信号通路抑制剂可间接促进DNA甲基化酶抑制剂对胃癌细胞的抑制作用，为肿瘤的治疗提供新思路．     

A型激酶锚定蛋白及其复合物结构与功能

A型激酶锚定蛋白(A-kinase anchoring proteins，AKAPs)是一类结构不同而功能相关的蛋白家族，其主要功能是将cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）锚定于特定的亚细胞结构.PKA是第二信使cAMP的主要效应器，而AKAPs在靶向定位和调节PKA介导的磷酸化事件方面扮演重要角色. AKAPs更为重要的功能是与多种信号分子形成信号复合物，从时间和空间上整合cAMP-PKA和其他信号途径.本文将对AKAPs及其信号复合物的结构特点和参与细胞信号转导的功能机制及其研究现状进行概述.     

凡纳滨对虾血蓝蛋白与病原菌凝集作用靶标的鉴定

血蓝蛋白是一种具有多种非特异性免疫学活性的多功能蛋白，以前的研究发现,血蓝蛋白具有凝集活性.本研究采用凝集抑制实验和亲和蛋白质组学等方法探索凡纳滨对虾血蓝蛋白与病原菌的凝集作用靶标.结果显示，大肠杆菌K12和副溶血弧菌外膜蛋白可以抑制血蓝蛋白对7种细菌的凝集活性，其中大肠杆菌K12中2种分子质量分别为16 kD、18 kD （命名为 p16、p18）的外膜蛋白可以与血蓝蛋白发生特异性的结合，经MALDI-TOF/MS鉴定，p16、p18 分别与大肠杆菌外膜蛋白OmpC、OmpX具有高度同源性.尤其是与大肠杆菌K12野生菌株相比，血蓝蛋白对 ΔOmpX 的凝集特异性明显降低，后者仅为前者的25％.由此推测，OmpX 应为血蓝蛋白与病原菌的凝集作用靶标.     

小立碗藓冷驯化相关基因Pp-LIM only A的克隆与表达

植物经历冷驯化后抗冻能力会有所提高.利用cDNA-AFLP方法从经过0℃冷驯化处理的小立碗藓中筛选到差异表达的Pp-LIM only A基因片段.cDNA和基因序列比较分析表明此基因含有7个内含子和8个外显子,编码由345个氨基酸残基组成的蛋白质,其中只含有一个LIM结构域,与动物蛋白质PDZ/LIM家族有很高的同源性,推测是一种新的植物LIM蛋白.实时定量PCR分析显示其在冷驯化6 h后表达量即开始明显增加,并随着冷驯化时间的延长表达量大幅度提高.Pp-LIM only A蛋白可能通过LIM结构域对细胞骨架的作用而影响了细胞膜的稳定性,本研究对其在抗冻中的作用作了进一步讨论.     

HPV18 E7致癌蛋白的高效表达、纯化和鉴定

目的为进一步研究人乳头状瘤病毒18（Human papillomavirus18，HPV18）E7蛋白的结构与功能。方法构建HPV18 E7的谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白质粒pGEX-6P-1-GST-HPV18 E7，重组质粒转入大肠埃希菌BL21进行可溶性融合蛋白的高效表达。结果柱上切除法去除GST标签，表达产物经glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化，获得了SDS-PAGE和HPLC-ESI-MS纯度的HPV18 E7均质蛋白，非变性PAGE和凝胶过滤表明HPV18 E7以稳定的单体形式存在于水溶液中。高压液相色谱-电喷雾质谱（HPLC-ESI-MS）分析得到HPV18 E7精确分子量为12865．0 Da，与其理论值吻合。纯化蛋白经HPLC-ESI-MS／MS鉴定为目的产物，鉴定出的9个匹配肽段覆盖率为HPV18 E7整个氨基酸序列的96．5％。结论本文所建立的技术可以有效地大量制备HPV18 E7，为进一步研究其结构与功能和致癌机制奠定了重要的物质基础。     

黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因的克隆与序列分析

以黑曲霉(A.niger)TCCC41013的总RNA作为模板,通过RT-PCR扩增出含自身信号肽的脯氨酸蛋白内肽酶基因,将其插入pUCm-T载体上,经PCR和酶切鉴定后进行测序并分析.所克隆的PEP基因全长为1 581bp,编码526个氨基酸残基,成熟肽为504个氨基酸残基.与GeneBank中已报道的A.niger CBS513.88的PEP序列同源性最高,达到99.75%.脯氨酸蛋白内肽酶是一种新型的丝氨酸蛋白酶,黑曲霉PEP与已克隆的其他菌种的PEP同源性不高.     

狂犬病病毒CVS株核蛋白基因的原核表达、纯化及鉴定

用KT-PCR技术对狂犬病病毒(RV)CVS株核蛋白(N)基因进行扩增,经克隆与序列分析,该基因编码450个氨基酸残基.将目的基因克隆到原核表达载体pET28a( )中,构建了重组质粒pET-N,将其转化表达菌BL21(DE3),于37℃1.0mmol/L IPTG条件下诱导表达.大肠杆菌菌体裂解产物经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为54kD处出现一新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符.质谱鉴定的结果表明成功表达了RV N蛋白,为狂犬病的进一步研究奠定了基础.