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1.
包涵体蛋白体外复性的研究进展   总被引:37,自引:1,他引:36       下载免费PDF全文
方敏  黄华樑   《生物工程学报》2001,17(6):608-612
外源基因在大肠杆菌中高水平表达时 ,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组蛋白 ,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠 ,才能够得到生物活性蛋白。近年来 ,发展了许多特异的策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白。最近的进展包括固定化复性以及用一些低分子量的添加剂等来减少复性过程中蛋白质的聚集 ,提高活性蛋白的产率。  相似文献
2.
包涵体复性研究进展(英文)   总被引:9,自引:2,他引:7       下载免费PDF全文
用基因工程技术在大肠杆菌高水平表达重组蛋白时,通常形成无生物活性的包涵体。包涵体在体外经分离、溶解与重折叠后可实现复性,表现为具有生物活性的蛋白。总结了包涵体的相关复性技术,重点介绍重折叠的最新进展情况 。  相似文献
3.
蛋白质的氧化重折叠   总被引:7,自引:0,他引:7       下载免费PDF全文
经过近几十年来广泛而深入的研究,蛋白质氧化重折叠的机制已得到相当详细的阐明。1在已研究过的蛋白质中,大多数蛋白质都是沿着多途径而非单一、特定的途径进行氧化重折叠,这与折叠能量景观学说是一致的。2正是氨基酸残基间的天然相互作用而不是非天然的相互作用控制蛋白质的折叠过程。这一结论与含非天然二硫键的折叠中间体在牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)折叠中所起的重要作用并非相互排斥,因为后者仅仅是进行链内二硫键重排的化学反应所必需,与控制肽链折叠无直接关系。3根据对BPTI的研究,二硫键曾被认为仅仅具有稳定蛋白质天然结构的作用,既不决定折叠途径也不决定其三维构象。这一观点不适用于其它蛋白质。对凝乳酶原的研究表明,天然二硫键的形成是恢复天然构象的前提。天然二硫键的形成与肽键的正确折叠相辅相成,更具有普遍意义。4在氧化重折叠的早期,二硫键的形成基本上是一个随机过程,随着肽链的折叠二硫键的形成越来越受折叠中间体构象的限制。提高重组蛋白质的复性产率是生物技术领域中的一个巨大的挑战。除了分子聚集外,在折叠过程中所形成的二硫键错配分子是导致低复性率的另一个主要原因。氧化重折叠机制的阐明为解决此问题提供了有益的启示。如上所述,在折叠的后期,二硫键的形成决定于折叠中间体的构象,类天然、有柔性的结构有利于天然二硫键形成和正确折叠,具有这类结构的分子为有效的折叠中间体,最终都能转变为天然产物;而无效折叠中间体往往具有稳定的结构,使巯基、二硫键内埋妨碍二硫键重排,并因能垒的障碍不利于进一步折叠。因此,降低无效折叠中间体的稳定性使之转变为有效折叠中间体是提高含二硫键蛋白质复性率的一条基本原则,实验证明,碱性pH、低温、降低蛋白质稳定性的试剂、蛋白质二硫键异构酶、改变蛋白质一级结构是实现这一原则的有效手段。此外,这里还就氧化重折叠的基础和应用研究的前景进行了讨论。  相似文献
4.
包含体的体外复性研究进展   总被引:3,自引:0,他引:3  
黄泓  张伟 《生命的化学》2003,23(5):397-400
在大肠杆菌中大量表达的重组蛋白质常常形成无活性的、不溶性的包含体。包含体经过液固分离、洗涤、变性溶解后,经过一个合理的复性过程可重新折叠成有活性的蛋白质。本文概述了常用的包含体复性方法,并对近年来出现的色谱复性法和应用一些低分子量添加剂等来提高蛋白质复性的产率做了简述。  相似文献
5.
以PCR方法从克隆的EGFR胞外区cDNA中扩增编码EGFR-L2结构域的DNA片段,在其3′端加入编码His6标签的序列,与pET-3c连接构建EGFR-L2原核表达载体。该蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,免疫印迹分析表明表达产物全部以包涵体形式存在,分步透析法和稀释法都不能获得可溶性复性产物,而Ni2+-NTA柱上复性法不仅能够获得可溶性的EGFR-L2蛋白,而且产物同时得到高度纯化,纯度>95%,复性的EGFR-L2与其配基EGF具有特异性的结合活性,但亲和力较低。这表明His6标签不但便于纯化目标蛋白,而且可利用Ni2+-NTA柱进行柱上复性,适用于不易通过常规方法复性的重组蛋白的制备。  相似文献
6.
蛋白质跨膜运送研究的新进展   总被引:2,自引:0,他引:2       下载免费PDF全文
本文对(1)分泌蛋白质、线粒体蛋白质跨膜运送的新进展,(2)蛋白质跨膜运送过程中的解折叠、重折叠与分子伴侣以及(3)蛋白质跨膜运送的机理研究概况作了扼要的介绍。  相似文献
7.
基因工程猪生长激素复性技术的研究   总被引:1,自引:0,他引:1       下载免费PDF全文
对基因工程猪生长激素(rpGH)体外复性条件进行研究,提取包涵体用6molL盐酸胍溶解,空气氧化80h后转入复性缓冲液中开始重组蛋白复性,结果表明,采用透析复性法———复性缓冲液Ⅲ(025%Na2CO3,02%乳糖,02%甘露醇),pH85,透析5~6次,可较好恢复rpGH生物活性。β巯基乙醇、谷光苷肽等添加剂对rpGH的体外复性影响不显著。复性后蛋白浓缩液进行去垂体大鼠试验,大鼠增重明显,表明得到了正确折叠的较高生物活性的rpGH。  相似文献
8.
9.
为研究A7 B7二硫键在胰岛素原结构和折叠中的作用 ,构建了A7 B7二硫键缺失的胰岛素原突变体 ,研究了其与野生型胰岛素原在体外重折叠产率、自由巯基氧化速度、CD谱、受体及抗体结合活性 ,以及对胰蛋白酶酶切敏感性的差别。结果表明 ,A7 B7二硫键缺失可导致胰岛素原α 螺旋明显减少以及对胰蛋白酶的酶切敏感性显著增加 ,其对胰岛素原结构的影响主要导致了受体结合活性的大幅度降低。突变体在体外重折叠 1h后巯基氧化速率较野生型明显减慢 ,但其最终折叠产率与野生型相当。由此提出一个胰岛素原折叠的可能途径 ,即A链链内二硫键最先形成 ,然后是两对链间二硫键。且A2 0 B19二硫键比A7 B7二硫键很可能先形成 ,在折叠中更重要。  相似文献
10.
将皖南尖吻蝮蛇毒Ⅰ型金属蛋白酶acutolysinA基因克隆进原核表达载体pBASD/gⅢA后得到重组表达质粒pDS,在0.02%的L-( )-阿拉伯糖的诱导下,质粒pDS在E.coliTOP10中表达了重组acutolysinA。与其天然形式相比,重组蛋白质在N端和C端各增加了22个和8个氨基酸残基(均源于载体序列)。并以包含体的形式存在于胞质中,表达量约占菌体总蛋白质的5%-10%。在经8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍变性及体外复性后,重组蛋白质获得了良好的免疫学及生物学活性,Western印迹及ELISA实验表明,天然金属蛋白酶acutolysinA与重组蛋白质具有良好的免疫反应相关性。动物实验表明,复性的重组蛋白质能明显引起皮下出血,其最低出血剂量约为20μg左右,1mmol/LEDTA,1mmol/LEGTA及3mmol/L咪唑均能不同程度的抑制天然及重组金属蛋白酶的出血活性,PMSF没有明显的抑制效果。并对出血毒金属蛋白酶的出血机制进行了探讨。  相似文献
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