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1.
毕赤酵母的密码子用法分析   总被引:134,自引:5,他引:129       下载免费PDF全文
通过分析Pichia pastoris的28个蛋白编码基因的同义密码子使用情况并计算该酵母的密码子用法,首次确定出P.pastoris的19个高表达优越密码子。这些结果经与已知的Saccharomyces cerevisiaeKluyveromyces lactis的密码子用法基本相似,但在氨基酸谷氨酸的密码子选择上截然相反,提示这可能属于P.pastoris所偏爱的密码子用法。  相似文献
2.
巴斯德毕赤酵母的基因表达系统研究进展   总被引:52,自引:1,他引:51       下载免费PDF全文
巴斯德毕赤酵母是一种近年来广泛使用的基因表达系统,它具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等许多优点.综述了该系统在载体类型、载体元件(包括启动子、选择标记和信号肽序列)、受体类型、以及提高整合拷贝数等方面的进展.  相似文献
3.
巴斯德毕赤酵母表达体系研究及进展   总被引:28,自引:0,他引:28       下载免费PDF全文
毕赤酵母表达体系是近十年发展起来的真核表达体系。作为一种成功的表达体系,有好几种因素促进了它的快速推广。主要包括如下几方面:    毕赤酵母醇氧化酶(Alcohol oxidase,AOXl)基因的强启动子特别适合于外源基因的调控表达;毕赤酵母基因操作技术和酿酒酵母Sccharomyces cerevisiae非常相似,后者是现代分子生物学中研究得透彻和应用很广的酵母表达体系;毕赤酵母对需氧生长有强的偏好,这一生理学特性使得它既能高密度发酵生长,亦有利于工业放大生产;毕赤酵母自身分泌到培养基中的…  相似文献
4.
本文以黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列,换用在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因(PhyA-as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合人酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDS-PAGE结果与表达产物酶这性质研究表明植酸酶得到分泌表达,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌,其中SPAN-Ⅲ菌株达到了在摇庆培养条件下,每毫升发酵液产生165000u植酸酶的水平,基本满足工业化生产的要求。  相似文献
5.
巴斯德毕赤酵母表达系统优化策略   总被引:25,自引:2,他引:23       下载免费PDF全文
巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris,Pp)表达系统是目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一。Pp的如下优点是促成此表达系统在近十几年里迅速发展和被广泛应用的重要原因 :Pp为单细胞真核生物 ,生长快 ,易于分子遗传学操作 ;Pp的醇氧化酶 1 (AlcoholOxidase 1 ,AOX 1 )基因的启动子具有强诱导性和强启动性 ,适于外源基因的高水平诱导表达 ;Pp具有强烈的好氧生长偏爱性 ,可进行细胞高密度培养 ,利于大规模工业化生产 ;Pp可高水平分泌表达外源蛋白 ,纯化方便 ;Pp具有真核细胞的翻译后…  相似文献
6.
信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响   总被引:23,自引:0,他引:23  
乙醇氧化酶启动子被分离、克隆 ,并建立了转化方法后 ,毕赤酵母已被发展成为一种高效的外源蛋白表达宿主。为了进一步提高外源蛋白质的分泌表达 ,对信号肽序列进行了研究。首先按毕赤酵母的偏爱密码合成了酿酒酵母的α因子信号肽序列MF4I,随后在MF4I信号肽序列的N端分别引入 1~ 10个毕赤酵母Aox1蛋白质的N端氨基酸 ,构成 10种不同的分泌信号肽序列 ,10种不同的分泌信号肽序列被用于植酸酶基因的毕赤酵母分泌表达。以上新的信号肽序列都可使植酸酶的分泌表达量增加 ,而以N端增加A、I、P三个氨基酸的信号肽序列引起的提高最大 ;和野生型的酿酒酵母α因子信号肽序列相比 ,使植酸酶分泌表达量增加 5倍 ,摇瓶中植酸酶的分泌表达量为 90mg/L。此外在MF4I信号肽的引导序列和内切蛋白酶间增加了EEAEAEAEP和K共 10个氨基酸 ,进一步提高信号肽的分泌效率 ,使表达又提高约 35 % ,使得摇瓶中酸性植酸酶的表达量达到 12 0mg/L ,是pPCI9K表达量的 8倍。  相似文献
7.
毕赤酵母表达猪干扰素—γ基因及其抑制蓝耳病毒效果   总被引:19,自引:0,他引:19  
为了研究和应用猪重组干扰素-γ(rPoIFN-γ)预防和治疗病毒性疫苗,将大白猪PoIFN-γ基因插入到酵母整合载体pHIL-S1,构建了重组GS115工程菌(pHIL-S1/rPoIFN-γ)。经过SDS-PAGE,Western blot分析和抗滤泡性口炎病毒(VSV)活性测定,证实了rPoIFN-γ分子量为18kD,在GS115中的表达量为18%。其抗VSV活性为450-540u/mL。用rPoIFN-γ处理猪肺巨噬细胞系Marc-145后,经细胞病变抑制法(CPE50)测定,rPoIFN-γ可以抑抗蓝耳病病毒(PRRSV)感染。结果显示酵母表达的rPoIFN-γ是有应用价值的抗病毒生物工程制剂。  相似文献
8.
选用毕赤酵母偏爱密码子 ,设计合成了新型抗菌肽基因。所合成的magainin基因和cecA mil杂合肽基因全长分别为 1 0 1bp和 60bp ,并在其N端引入kex2裂解位点 ,以保证表达抗菌肽具有天然N端。其中 ,cecA mil杂合肽基因根据cecropinAN端第 1~ 7个氨基酸残基、melittinN端第 5~ 1 2个氨基酸残基所设计合成。基因分别克隆入pPICZα A质粒 ,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα A mag和pPICZα A CM。在AOX1 (醇氧化酶 )启动子调控下 ,类似天然抗菌肽大小的magainin及cecA mil蛋白获得分泌表达 ,其表达量分别为 1 0 5mg L和 1 1 8mg L。初步抑菌活性测定 ,显示两者对金黄色葡萄球菌及E .coliDH5α有较好的抑杀活性。  相似文献
9.
高效表达具有生物学活性的植酸酶的毕赤酵母   总被引:17,自引:0,他引:17       下载免费PDF全文
对来源于Aspergillusniger 96 3的植酸酶基因 phyA2进行了改造 ,包括去掉基因中的内含子和信号肽编码序列 ,在不改变所编码氨基酸的情况下 ,定点突变优化了对此基因在酵母中高效表达起关键作用的Arg密码子 .经改造的植酸酶基因按正确的阅读框架融合到毕赤酵母 (Pichiapastoris)高效表达载体 pPIC9上的α 因子信号肽编码序列 3′端 ,重组表达载体电击转化毕赤酵母得到重组转化子 ,经Southernblotting分析证实了植酸酶基因已整合到酵母基因组中 ,并确定了基因整合的拷贝数 .Northernblotting分析证明植酸酶基因能进行正常的转录 .SDS PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明 ,植酸酶能有效分泌和高效表达 (Arg密码子优化后其表达量可达每毫升培养液 1 5 0 0 0U ,比Arg密码子没有优化的表达量高约 37倍 ,比原菌株A .niger 96 3的表达量高约 30 0 0倍 ) ,表达产物具有正常的生物学活性 .这是迄今为止我国饲料工业中 ,构建的第 1株具有实用价值和应用前景的生产饲料添加剂的基因工程菌株  相似文献
10.
利用重叠PCR技术在体外拼接IFN β和HSA基因,将得到的融合基因插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,置于启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白IFNβ-HSA。重组质粒pPIC9K-IFNβ-HSA经SalI线性化,电击转化毕赤酵母KM71,经G418筛选得到高拷贝转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达的融合蛋白IFNβ-HSA表明该蛋白分子量约为90kDa且具有HSA的抗原性;用细胞病变抑制法测定发酵液上清中融合蛋白的干扰素活性约为640IU/ml。  相似文献
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