肝癌特异性鼠源及人源化单链抗体基因的构建及大肠杆菌中的表达

为探讨一株肝细胞癌特异性鼠源及其人源化单链抗体基因在大肠杆菌中的可溶性表达策略并比较二者对抗原的结构能力，在三种载体中分别以融合、分泌及胞内表达的方式进行了研究，表达产物均以包涵体形式存在；对复性后的单链抗体以细胞ＥＬＩＳＡ及竞争抑制流式细胞仪法进行检测，表明人源化单链抗体和鼠源单链抗体有相近的抗原结合能力。结论是：大肠杆菌中表达的基因工程单链抗体的可溶性可能主要由自身氨基酸一级序列决定；先前的设  

大肠杆菌二硫键形成相关蛋白的结构、功能及其在基因工程表达外源蛋白上的应用

大肠杆菌分泌蛋白二硫键的形成是一系列蛋白协同作用的结果，主要是Dsb家族蛋白，迄今为止共发现了DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、DsbE和DsbG。在体内，DsbA负责氧化两个巯基形成二硫键，DsbB则负责DsbA的再氧化。DsbC和DsbG负责校正DsbA导入的异常二硫键，DsbD则负责对DsbC和DsbG进行再还原，DsbE的功能与DsbD类似。除了直接和二硫键的形成相关外，DsbA、DsbC和DsbG都有分子伴侣功能。它们的分子伴侣功能独立于二硫键形成酶的活性并且对二硫键形成酶活性具有明显的促进作用。基于Dsb蛋白的功能特性，利用它们以大肠杆菌为宿主表达外源蛋白，特别是含有二硫键的蛋白，取得了很多成功的例子。本文简要介绍了这方面的进展，显示Dsb蛋白在促进外源蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达方面具有广阔的应用前景。  

抗癌胚抗原单链抗体基因的构建及高效表达

采用重组ＰＣＲ技术将已获得的抗癌胚抗原鼠源单克隆抗体Ｅ７Ｂ１０重，轻链可变区基因经（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３编码的寡核苷酸拼接成单链抗体基因，并在大肠杆菌中高效表达了单链抗体Ｃ端的融合蛋白，其表达量达到菌体总蛋白的２０％，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹图谱显示表达产物分子量为２７ｋＤ，与其基因编码蛋白的理论推算值相符。  

人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体-尿激酶融合蛋白在大肠杆菌中的功能性表达

尿激酶是目前临床上广泛使用的一种有效的溶栓制剂 ,但由于尿激酶缺乏对血栓的特异亲和性 ,导致临床上尿激酶的使用剂量较大 ,容易出现全身性出血等副作用。因而开发对血栓特异的导向溶栓制剂是目前溶栓药研制的一个重要方向。本实验室在以前的工作中 ,利用噬菌体表面呈现技术 ,筛选到一种对人纤维蛋白特异的鼠单链抗体[1 ] ,在对该鼠抗体可变区进行结构模建的基础上[2 ] ,对其进行了人源化改造和体外亲和力成熟 ,得到亲和力和特异性较鼠抗体更好的人源化单链抗体[3 ] 。为研制导向溶栓制剂 ,本实验室构建了人源化单链抗体 低分子量尿激酶的…  

抗人CD19单链抗体基因的构建、表达及功能测定

采用RT-PCR方法从分泌抗人类白细胞表面分化抗原CD19单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆出V_H和V_L可变区基因，再通过重叠延伸拼接（spliceoverlap extension）PCR方法在V_H和V_L可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗人CD19单链抗体（抗CD19-ScFv）基因。将其克隆至表达载体PET28a并在大肠杆菌中表达。SDS-PAGE和Westernblot分析结果表明，抗CD19-ScFv在BL21（DE3）菌中获得表达，重组蛋白的相对分子量为27kD，表达产物以不溶性包涵体形式存在，经过溶解包涵体，镍柱亲和层析纯化和体外复性过程，获得了高纯度的单链抗体片段。流式细胞分析结果证实抗CD19ScFv可与人类白细胞表面的分化抗原CD19结合，保留了鼠源性单抗与CD19结合活性。抗人CD19-ScFv的构建与表达，为下一步针对B淋巴系统恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础。  

抗肝癌单链抗体的活性检测

将抗肝癌单克隆抗体 ＨＡｂ２５的轻、重链可变区基因通过Ｌｉｎｋｅｒ连接起来，构建成抗肝癌单链抗体ｓｃＦｖ２５，然后亚克隆入含 Ｅ－ｔａｇ检测标签的 ｐＥＴ１５ｂ表达载体进行融合表达。表达产物（ｓｃＦｖ２５－Ｅ－ｔａｇ）采用 ＳＡＢＣ法对肝癌细胞涂片进行染色，利用鼠抗Ｅ－ｔａｇ抗体间接检测初步纯化的ｓｃＦｖ２５的活性，同时采用竞争结合实验检测ｓｃＦｖ２５的亲和活性。ｓｃＦｖ２５能够与靶细胞特异性结合，阳性部位主要定位于细胞膜上；ｓｃＦｖ２５可封闭５３％的亲本抗体的亲和活性。ｓｃＦｖ２５较好地保持了亲本抗体的特异性和亲和活性。  

人源抗HBsAg单链抗体在巴氏毕赤酵母中的表达

在P.pastoris中分泌表达非融合抗HBsAg单链抗体（HBscFv）。设计引物从pGEMHBscFv上扩增目的基因，亚克隆至P.pastoris表达载体pPICZαA中，线性化后转化P. pastorisGS115；转化子经菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定后，甲醇诱导目的蛋白表达。结果发现，重组HBscFv可以在α因子的引导下，分泌至培养基中，产量为80mg/L；分泌至培养基中的HBscFv具有结合HBsAg活性，活性总量在诱导培养72h后达最高峰，在诱导培养后期，HBscFv活性下降；PAS糖显色结果表明，酵母表达HBscFv是一种低糖基化蛋白或非糖基化蛋白。  

抗大肠癌噬菌体单链抗体的筛选及初步鉴定

 应用 3种方法 (肿瘤细胞膜表面和胞内、裸鼠体内和组织切片 ) ,从全人源化的抗大肠癌噬菌体初级抗体库中筛选肿瘤特异性的噬菌体单链抗体 (Sc Fv) .在肿瘤细胞经过 3轮亲和选择 ,回收结合胞膜和内化进入胞内的噬菌体 ,得到抗肿瘤噬菌体单链抗体的富集倍数为 430倍 ;荷瘤裸鼠体内注入初级抗体库后 ,在不同时刻点处死裸鼠 ,回收肿瘤组织内的噬菌体 ,其回收率在 2 4 h时最高 ;初级抗体库与大肠癌组织切片亲和选择后 ,从冰冻组织切片上比从石蜡组织切片上回收得到的噬菌体高出约 1 .6倍 .从上述方法挑选单克隆 ,经 ELISA筛选抗大肠癌阳性噬菌体克隆株 ,分离得到 5个对大肠癌细胞反应较好的单克隆噬菌体单链抗体 .进一步用细胞 ELISA检测对各种肿瘤细胞的特异性反应 ,其中 4个对大肠癌细胞有很好的特异性 ,1个克隆对所有肿瘤细胞均有反应 .因此 ,3种方法用于筛选抗大肠癌噬菌体初级抗体库是有效的 ,具有推广和应用价值 .  

抗HBsAg人源单链可变区抗体的筛选与可溶性抗体的表达

采用噬菌体表面展示技术，以从乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)阳性血清超速离心纯化的HBsAg为固相抗原，从噬菌体单链可变区半合成抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程，获得特异性较强的HBsAg人源单链可变区抗体(ScFv)克隆并提取质粒，经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后，亚克隆到pCANTAB5E表达载体中，转化大肠杆菌XL1-Blue。经IPTG诱导后，表达的可溶性HBsAg特异性ScFv以50%硫酸胺沉淀，经SDS-PAGE电泳表明，XL1-Blue中表达的HBsAg可溶性ScFv的分子量约28?kD。免疫活性检测结果表明，该单链抗体具有较强的抗原结合活性和特异性。HBsAg人源单链抗体的筛选和表达成功，为今后HBsAg人源抗体的研究和应用奠定了基础。  

导向性纤溶酶原激活剂的研究

溶栓疗法是血栓治疗中的一种重要措施.研制具有高选择性的导向性纤溶酶原激活剂有着重大的理论意义和实用价值.采用血栓特异的单克隆抗体及其片段来介导溶栓剂已展示出较好的应用前景.双功能抗体以及同时具有抗栓，抗凝活性的小肽正逐渐拓宽人们有关导向分子研制的视野.所有这一切都将随着分子生物学技术的不断完善而付诸实现.