一种多基因串联共表达载体的构建

为了构建一种可用于串联共表达多个基因的原核表达载体,通过PCR引入点突变,对商业载体pET-22b的酶切位点进行定向改造,设计独特的XbaⅠ/SpeⅠ模块。获得改造成功的载体pET-m22b,测序结果显示启动子、核糖体结合位点、多克隆位点及终止子均位于XbaⅠ和SpeⅠ两酶切位点间。选取不同来源的基因进行串联组合及表达鉴定,四个基因成功组合于同一载体中,表达效果良好,各基因表达效率不受明显影响。研究构建的载体pET-m22b,使多基因的共表达更加便捷,为蛋白复合物的表达与纯化、代谢通路的异源重建及其优化等研究奠定了良好的基础。  

一株木质纤维素降解菌的筛选及其全基因组分析

[目的] 筛选和鉴定有木质纤维素降解能力的1株细菌,测定其相关酶活力并进行全基因组分析,为构建木质纤维素降解工程菌提供依据。[方法] 采用3种木质素类似物(天青-B;酚红;愈创木酚)的脱色/染色法,从腐木和被枝叶覆盖的土壤中分离和筛选出1株具有较强木质纤维素降解能力的细菌。通过16S rRNA基因和全基因组序列分析对该菌进行种属鉴定。使用紫外分光光度法测定其锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)、羧甲基纤维素酶(CMCase)以及滤纸酶(FPA)活力,了解该菌相关酶活力大小在一定时间内的变化趋势。使用Illumina Miseq和454 GS Junior测序平台获取该菌的全基因组序列,将其全基因组序列经过注释的基因蛋白质序列提交COG和KEGG数据库进行BLASTp比对分析,确定该菌潜在的重要酶类和代谢途径,并对部分注释基因进行定量RT-PCR验证。[结果] 筛选得到1株优势菌株S12,该菌经鉴定后命名为解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)。在液体CMC-Na培养基中发酵28 h,菌体生长达到稳定期,纤维素降解相关酶活力也在此时达到峰值。生物信息学分析结果表明,菌株S12具有木质素降解通路中重要酶类的编码基因,如过氧化物酶、Fe-Mn型超氧化物歧化酶、邻苯二酚1,2-双加氧酶和原儿茶酸-3,4-双加氧酶等,这些基因在以碱性木质素为碳源的培养条件下表达量不同程度地高于以葡萄糖为碳源的培养条件。另外,菌株S12具备完整的纤维素降解和乙醇生成通路。[结论] 本研究首次揭示了Raoultella ornithinolytica S12具备有效的木质纤维素降解性能,这对于推动木质纤维素应用产业的发展具有重要意义。  

沉默lycB基因对雨生红球藻类胡萝卜素合成代谢的影响

雨生红球藻是一种淡水浮游单细胞绿藻,逆境条件下可积累大量的类胡萝卜素。番茄红素是类胡萝卜素中的一种,是类胡萝卜素合成代谢中的一个重要中间产物。番茄红素β-环化酶(LycB)是催化番茄红素形成β-胡萝卜素的关键酶。文章以杜氏盐藻lycB基因为干扰序列,构建了含卡那霉素与阿特拉津双抗性的RNAi载体p1301-BS-RNAi。将其电转化进雨生红球藻细胞,经抗性筛选、基因组PCR及RT-PCR筛选,获得了16个独立的干扰株系。选取生长良好的7个进行高光诱导,发现其番茄红素含量增加了99.4%,β-胡萝卜素含量减少了48.4%,即通过异源的lycB-RNAi基因沉默可抑制番茄红素向β-胡萝卜素的转化。对比分析发现,番茄红素增加量仅是β-胡萝卜素减少量的5%,表明因lycB-RNAi抑制而产生的番茄红素的95%又被其他通路转换成了其他代谢产物,因此要实现雨生红球藻番茄红素含量的大幅增长,需协同调控其他代谢通路。  

丙酸通路基因多态性与猪肉质及胴体性状的关联分析

为了挖掘新的猪肉品质及胴体性状的候选基因,揭示猪肉质及胴体性状的遗传机制,文章将丙酸代谢通路作为候选通路,将通路内基因与猪肉质及胴体性状进行关联分析。实验采用37头三元杂交商品猪作为研究对象,首次针对丙酸通路中7个基因的36个SNP位点利用SNaPshot方法进行基因分型,分别用最小二乘模型及MB-MDR模型与肉质及胴体性状进行关联分析。结果发现,基因PCCB、MUT、MCEE及ACSS2上的4个SNP位点分别与肌内脂肪含量、背膘厚等性状显著相关(P<0.05),ACSS2与猪脂肪含量显著相关;MCEE及MUT与猪的背膘厚显著相关;PCCB基因与脂重显著相关。通过MB-MDR方法检测到多个SNP位点具有互作效应,并与背膘厚、水分含量、脂肪含量显著相关(P<0.05)。另外,丙酸代谢通路中的基因间的互作效应对猪肉品质有显著影响。  

糖尿病肝脏基因表达谱代谢学分析

目的:探讨糖尿病患者肝脏与正常对照肝脏基因表达谱的变化,并进行代谢通路生物信息学分析.方法:应用Affymetrix的Human Genome U133A array芯片检测糖尿病肝脏组织(n=2)和正常对照肝脏组织(n=2)的基因表达谱变化,通过DAVID分析平台对芯片监测到的表达上调的基因进行KEGG通路分析,并用RT-PCR验证部分基因的表达情况.结果:以比值大于2或小于-2为准,共有492条基因明显上调,820条基因明显下调;在差异表达明显的前20位基因中,涉及氧化应激、免疫炎症反应和脂代谢.KEC-G代谢通路分析显示:该差异表达基因谱符合2型糖尿病的发病机制,其差异表达明显基因的代谢通路涉及胰岛素信号通路、脂代谢、补体和凝血系统、糖代谢、粘附功能和细胞因子和受体的相互作用.RT-PCR证实差异表达明显基因SOD2mRNA和CRPmRNA确实表达明显上调.结论:糖尿病肝脏与正常肝脏组织基因表达谱的变化在代谢通路上主要表现为在糖、脂代谢和胰岛素信号通路、补体和凝血系统等的改变,肝脏在糖尿病发病机制中的作用可能与其参与糖脂代谢和胰岛素的作用异常有关.  

木薯品种(系)类胡萝卜素代谢相关基因和蛋白表达水平分析

以白心木薯华南6068、华南9号、紫叶黄心木薯BGM019和粉红木薯Mirasol为材料,探究木薯块根膨大期和成熟期与类胡萝卜素代谢通路相关的14个基因和4种蛋白质表达水平变化.用HPLC检测块根β-胡萝卜素含量的变化,分别用qRT-PCR和Western blot方法对类胡萝卜素代谢通路相关基因和蛋白酶的表达水平进行分析.以华南6068为对照,研究结果表明:华南9号和紫叶黄心木薯BGM019成熟期中的类胡萝卜素合成途径关键基因PSY2、LCYB基因显著高于膨大期,而降解相关的关键基因CCD1、NCED3在成熟期的表达量显著低于膨大期(P＜0.05).粉红木薯Mirasol成熟期中PSY2、LCYB的显著下调与CCD1、NCED3的显著上调(P＜0.05)是造成β-胡萝卜-素含量差异的原因之一.通过分析不同木薯品种(系)在膨大期和成熟期决根类胡萝卜素代谢途径相关基因的表达水平,有助于解析β-胡萝卜素积累的分子机理.此外,Western blot结果显示抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶和HSP70虽然和块根类胡萝卜素代谢途径没有直接关联,但它们在木薯膨大期和成熟期块根表达水平有显著差异(P＜0.05).  

生物柴油新原料——微生物油脂

生物柴油是替代传统石化能源的重要途径,但高昂的原料油成本限制其进一步应用。微生物油脂具有价格低廉、供给充足和不占用耕地资源等优点,是理想的生物柴油原料油脂。对微生物油脂组成成分,提取和测定方法等方面进行详细介绍,并重点综述转座标签育种、代谢通路调控育种、转录因子调控育种和发酵过程优化等技术在提高细胞油脂积累量方面的应用进展,探讨以微生物油脂为新原料制备生物柴油的优点及可行性。  

Helicobacter pylori 26695 基因组尺度代谢研究进展

代谢网络在代谢功能研究、生物代谢过程控制、疾病诊断分析和药物靶标设计等方面具有重要理论和实践意义。生物信息学研究利用序列同源、结构模拟、对接等手段与生化实验有效结合促进了生物体代谢网络的进一步完善。本文作者在构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori 26695,H.pylori 26695）代谢网络的工作基础上综合了近年来研究者对H.pylori 26695代谢通路关键酶的研究成果,并结合基因组信息,综述了H.pylori 26695特异性的重要代谢通路。本文从基因组水平阐明代谢通路与基因的关系,并详细分析了关键酶对H.pylori 26695生理的重要作用,最后探讨了重构一个连续、完整的代谢网络面临的困难及其在药物靶标设计方面的研究前景。  

草菇子实体不同成熟阶段的比较蛋白质组学分析

采用iTRAQ标记结合二维液相色谱串联质谱技术对草菇不同成熟阶段的差异蛋白质组进行研究。首先将提取的草菇不同成熟阶段蛋白样品进行SDS‐PAGE分析,其次将经二维液相色谱串联质谱技术获取的串联质谱数据通过MASCOT软件搜库,之后对鉴定蛋白质数据进行了KEGG代谢通路分析。试验共计获得2 335个不同肽段,鉴定到1 039个蛋白质,其中1 030个蛋白质具有定量信息。与蛋形期相比,在伸长期和成熟期阶段显著上调蛋白质85个,下调蛋白质103个。KEGG代谢通路分析结果显示,草菇不同成熟阶段中的68个差异蛋白质可定位于4种伞菌目模式真菌(灰盖鬼伞、双色蜡蘑、可可丛枝病菌和裂褶菌)的45个不同生物代谢途径,全景展示出草菇成熟阶段差异表达蛋白质定位的代谢网络。结果表明,iTRAQ标记技术结合二维液相色谱串联质谱可对不同生长发育时期的草菇蛋白样品进行有效地分离和鉴定。  

砷氧化菌株的筛选及Bosea sp.AS-1基因组分析

[目的] 对湖南省锡矿山地区的砷氧化菌株的种属进行初步鉴定，并对砷锑氧化菌株Bosea sp.AS-1（简称AS-1）进行全基因组测序和生物信息学分析。[方法] 分离砷氧化菌株，并利用16S rRNA基因测序进行菌种鉴定。在此基础上，对能够高效氧化砷的菌株AS-1进行全基因组测序，对测序数据进行基因组装和功能注释、COG、GO及KEGG聚类分析，以及次级代谢产物合成基因簇与代谢途径预测等。[结果] 湖南省锡矿山的砷氧化菌株主要分布在α-、β-、γ-变形菌纲以及厚壁菌门。菌株AS-1基因组的测序结果显示AS-1基因组包含一条大小为5.536 Mb环状染色体和两个大小分别为189.9 kb和112.1 kb的质粒。对AS-1基因组进一步分析发现该菌株的基因组中包含砷锑代谢相关基因，还有鞭毛形成、鞭毛运动及生物膜形成的基因，这些基因的存在可能与AS-1能高效耐受和氧化砷和锑的特性相关。此外，菌株AS-1中还存在部分碳固定基因和硫氧化基因，这暗示着AS-1能够进行自养生长并氧化环境中的硫元素。[结论] 菌株AS-1可以在自养条件下生长并且能够氧化Sb（III）为Sb（V）。