用Cre/LoxP和CRISPR基因工程技术构建猪肌肉生长抑制素双等位基因敲除细胞系

肌肉生长抑制素 (myostatin,Mstn)基因失活可引起哺乳动物的肌肉增生,但其调控机制尚不清楚,且缺乏可靠的试验材料验证Mstn相关分子通路的变化。本研究所用PK3108细胞系是在野生型PK15细胞系的基础上成功靶向敲除一条等位基因,在其靶位点敲入标记基因,敲除了204 bp的外显子3序列, LoxP锚定在其标记基因两侧。利用Cre/LoxP重组酶删除系统删除插入PK3108Mstn靶位点的标记,借助流式细胞仪和荧光蛋白甄别得到无标记的过渡型细胞系PK3108-2。将Cas9/sgRNA表达载体和供体DNA共转染PK3108-2,借助G418抗性筛选和倒置荧光显微镜挑选出仅带阳性标记的克隆L18,对其基因组进行PCR产物凝胶电泳与PCR产物测序,证明克隆L18在预设位点发生同源重组;对其蛋白质进行Western 印迹实验表明,Mstn被成功地敲除失活。综上结果证明,本研究实现了双等位基因的精准敲除,构建了Mstn双敲除梯度回复表达细胞系。本研究为揭示Mstn的作用机制提供理想的实验材料,也为双等位基因的敲除提供了可借鉴的技术路线。     

用Cre/LoxP和CRISPR基因工程技术构建猪肌肉生长抑制素双等位基因敲除细胞系北大核心CSCD

肌肉生长抑制素(myostatin,Mstn)基因失活可引起哺乳动物的肌肉增生,但其调控机制尚不清楚,且缺乏可靠的试验材料验证Mstn相关分子通路的变化。本研究所用PK3108细胞系是在野生型PK15细胞系的基础上成功靶向敲除一条等位基因,在其靶位点敲入标记基因,敲除了204bp的外显子3序列,LoxP锚定在其标记基因两侧。利用Cre/LoxP重组酶删除系统删除插入PK3108Mstn靶位点的标记,借助流式细胞仪和荧光蛋白甄别得到无标记的过渡型细胞系PK3108-2。将Cas9/sgRNA表达载体和供体DNA共转染PK3108-2,借助G418抗性筛选和倒置荧光显微镜挑选出仅带阳性标记的克隆L18,对其基因组进行PCR产物凝胶电泳与PCR产物测序,证明克隆L18在预设位点发生同源重组;对其蛋白质进行Western印迹实验表明,Mstn被成功地敲除失活。综上结果证明,本研究实现了双等位基因的精准敲除,构建了Mstn双敲除梯度回复表达细胞系。本研究为揭示Mstn的作用机制提供理想的实验材料,也为双等位基因的敲除提供了可借鉴的技术路线。     

缓冲蛋白胨水前增菌对冷鲜鸡表面微生物变化的影响

缓冲蛋白胨水(Buffered peptone water,BPW)是常用于微生物分离培养的增菌液,为了解BPW增菌对微生物结构的影响,以冷鲜鸡污染微生物为研究对象,在杭州超市采集20只冷鲜鸡样品,分别用BPW增菌0、2、6、12、24 h,检测菌落总数的变化,分析不同增菌时间对沙门氏菌检出率的影响。并选择2只冷鲜鸡不同增菌时间的BPW增菌液,提取细菌基因组DNA,分别用DGGE分析和高通量测序分析其菌群结构变化。结果显示,菌落总数随增菌时间增加而增加,增菌6 h后极显著增加(P 0. 01),增菌24 h与其他时间差异极显著(P 0. 01);沙门氏菌检出率在BPW增菌的前0～12 h增加,随着增菌时间的延长而增加,其中增菌12 h阶段检出率最高,为40%,而在24 h时下降,为15%。DGGE结果显示,增菌0～12 h条带丰富,24 h条带减少,与增菌0～12 h的菌群结构有显著不同的聚类。高通量测序显示在门的水平上,变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)是冷鲜鸡表面优势菌门,占85%以上;在BPW增菌24 h后,菌群结构发生较大变化,变形菌门相对丰度降低,厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度增加。在属水平上,BPW增菌12 h以内,优势菌主要为不动杆菌属(Acinetobacter)、希尔氏菌属(Shewanella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter),而BPW增菌24 h后,在未增菌前,相对丰度较低消化链球菌属(Peptostreptococcus)、梭杆菌属(Fusobacterium)、变形杆菌属(Proteus)、漫游球菌属(Vagococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)和摩根氏菌属(Morganella)成为主要的优势菌。由此说明BPW增菌时间对沙门氏菌的检出率、微生物数量和菌群结构有显著的影响,在前增菌时应选择合适的增菌时间。     

鼠伤寒沙门菌小RNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpD的表达调控

【目的】探究小RNA (small RNA, sRNA) RybB和伴侣蛋白Hfq对沙门氏菌孔蛋白OmpD表达的调控作用。【方法】以鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium, STM)为研究对象,将含有编码β-半乳糖苷酶的lacZ报告基因的pCE40质粒转入ompD基因单缺失菌株中以获得lacZ报告菌株;在此基础上,利用P22噬菌体转导技术分在lacZ报告菌株中构建rybB全序列缺失、hfq全序列缺失、hfq点序列敲除和hfq序列截短以获得双突变实验菌株,以及rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株。通过β-半乳糖苷酶活性试验和RT-qPCR探究sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpD表达的调控作用。【结果】成功在lacZ报告菌中构建rybB全序列缺失、hfq全序列缺失、hfq点序列敲除和hfq序列截短等双缺失实验菌株,以及rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株。与野生型(wild type, WT)菌株相比,在lacZ报告菌株中,hfq基因截短为87个氨基酸序列的突变株中的OmpD蛋白活性下调了2.16%,其余实验株OmpD蛋白的β-半乳糖苷酶活性均呈上升趋势。与WT菌株相比,实验菌株ompD基因转录水平除了STM LT2∆ompD::lacZΔhfq65的上调不具有显著性外,其余实验菌株均显著(P<0.05)上调,其中lacZ报告菌株、rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株ompD基因转录水平上调最明显,为1.83倍。【结论】ompD基因的转录及蛋白表达主要受hfq基因和sRNA RybB的负反馈调节;Hfq的远端面在对ompD基因的转录抑制中起关键作用。通过多个基因突变菌株的构建,阐述了sRNA伴侣蛋白Hfq与孔蛋白OmpD的相互作用关系,探索了Hfq对ompD的调控关键区域,丰富了sRNA的调控理论。