全局转录机器工程——工业生物技术新方法

美国和英国的研究人员在2006年1月出版的<科学>杂志上发表文章称: 工业生物技术是一种新的工业制造概念……并将成为一种新的制造技术典 范①.采用以微生物酶或细胞为主体的工业生物技术生产大宗化学品和能源、材料、医药产品,已经成为全世界--尤其是我国解决资源、能源和环境危机的重要手段②.     

产腈水解酶菌株的诱变及培养优化

对实验室保存的1株产腈水解酶的Rhodococcus rhodochrous菌株采用氯化锂进行诱变处理,筛选得到了1株产酶活力较高的菌株tg1-A6。经过优化得到培养基的配方为(g.L-1):葡萄糖10,谷氨酸钠10,酵母膏3,己内酰胺7,MgSO40.5,K2HPO40.75,KH2PO40.75。当培养温度28℃,摇床转速200 r.min-1,初始pH值7.0,通过补加葡萄糖,该菌的腈水解酶酶活可达到26.77 U.mL-1。     

热带假丝酵母代谢烷烃过程中的β-氧化和代谢调控

热带假丝酵母(Candida tropicalis)能利用烷烃作唯一碳源和能源.当以烷烃或脂肪酸为碳源时,在细胞内可形成大量的过氧化物酶体(peroxisome),同时诱导生成脂肪酸β-氧化酶系,当以葡萄糖为碳源时,则极少有过氧化物酶体形成[1],一些C.tropicalis能氧化烷烃生成长链二元酸(long chain dicarboxylicacid,DCA).由于这些特征,人们从酶学、分子生物学和实际应用等方面对这种酵母进行了深入研究,并阐述了C.tropicalis代谢烷烃的途径、脂肪酸β-氧化酶系的生理功能及其几种重要酶的基因结构和酶活性的调控,阐明了它与哺乳动物细胞在脂肪酸代谢及调控方面上的差异;通过C.tropicalis突变株的筛选和发酵工艺的优化,使长链二元酸发酵技术实现了产业化[2,3].     

微生物法生产丙烯酰胺的研究（Ⅱ）——腈水合酶催化反应动力学与失活动力学

以丙烯腈为原料,微生物转化生产丙烯酰胺的过程中,酶催化反应是过程的关键。为了了解酶催化的动力学,本研究以自由细胞的酶为催化剂,进行了腈水合酶的反应动力学和失活动力学的研究。首先研究了菌体浓度、温度、pH值、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度等对腈水合酶催化反应速度的影响。结果表明,在这些因素中,温度和丙烯酰胺浓度是最主要的影响因素。28℃时酶活为5659u/mL（菌液）,在5℃时的反应速率仅为28℃时的11.72%,相应的表观酶活为663u/mL（菌液）。而在丙烯酰胺45%浓度条件下的酶活大约只有丙烯酰胺5%浓度下的酶活的1/2。经过对不同温度下的反应速度的研究,得到腈水合酶水合反应的活化能为65.57kJ·mol^-1。本文进一步研究了自由细胞状态下,菌体浓度、pH值、温度、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度对腈水合酶失活的影响,得到了失活动力学。结果表明,在这些因素中,对酶失活影响的最主要因素还是温度和丙烯酰胺浓度。尤其当丙烯酰胺浓度到达35%时,酶活下降得很快,在55 h后,酶活几乎为零。而在丙烯酰胺浓度为10%的情况下,55 h的酶活仍然还存在约50%。试验结果还表明,丙烯腈对酶的稳定性的影响很小。经过数据处理,得到的28℃的酶失活速率常数为5℃下的2177倍。经过对温度与失活速率常数的拟合,得到腈水合酶失活反应的活化能为9228kJ·mol-1。     

钙离子对热带假丝酵母CT 1-12细胞生长影响的初步研究

研究了Ca^2 对热带假丝酵母增殖的影响,发现钙离子的加入对细胞增殖是有促进作用的,可以加快细胞周期,促进作用的强弱依Ca^2 浓度不同而异,最适浓度在10^-4-10^02mol/L之间。浓度过高（高于10^-1mol/L）会对生长起抑制作用。最佳钙离子浓度下同期菌浓比空白样高出34％。     

蛭弧菌BDG-9质粒不稳定性研究

本文建立了研究难于单独连续培养的专性蛭孤菌质粒稳定性的方法体系。应用此方法体系发现并证明了在传蛭孤菌ＢＤＧ－９中所含的质粒ｐＳＴⅠ存在着独特的质粒缺失现象,当蛭弧菌ＢＤＧ－９单独培养时,在通常决定质粒稳定性的复制功能和分配功能都正常的情况之下,随着细胞的传代,质粒ｐＳＴⅠ逐渐丢失,蛭弧菌的生长繁殖也逐渐停止,表明质粒ｐＳＴⅠ的存在对ＢＤＧ－９细胞单独生长有重要作用。     

腈水合酶基因克隆与调控表达的研究进展

微生物腈水合酶作为新型生物催化剂得到日益广泛的应用 ,但野生菌株本身存在的酶稳定性差等问题制约了这一绿色工艺的发展 ,基因工程菌为解决这个难题开辟了新的思路。总结了各种菌株中腈水合酶的序列研究进展 ,虽然基因序列和蛋白序列同源性不高 ,但它们都以基因簇的形式存在 ,并具有相同的活性中心序列。归纳了克隆并表达腈水合酶基因的基本步骤和方式 ,并提出几种有效增强重组腈水合酶活性表达的方法。     

H2O2对热带假丝酵母醇氧化酶的影响及其作用机理分析

考察了H2 O2 对热带假丝酵母代谢烷烃生产二元酸过程中醇氧化酶 (fattyalcoholoxidase ,AOX)的影响。研究表明 :2mmol L和 5mmol L的H2 O2 对AOX的比酶活有明显的促进作用 ,分别比对照提高了 68 2 %和 82 9%。研究还发现 ,H2 O2 是以超氧阴离子自由基等形式在胞内存在 ,并对H2 O2 在代谢过程中的作用机理进行了分析。     

高效测定发酵液中透明质酸含量的改良CTAB浊度法

透明质酸（HA）在保健品、化妆品及临床医疗等领域都具有重要应用,发酵法是HA生产的主要方法。发酵液中HA含量的快速、准确测定对于HA的生产具有重要意义。在原始十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）浊度法测量HA浓度的基础上,提出了去除HA与乙酸缓冲液混合后的水浴步骤、降低CTAB试剂浓度（2.5 g/L）以及确定HA-CTAB络合反应时间（5 min）的改良CTAB法。进一步研究了发酵液各成分对改良CTAB方法的干扰,结果表明,葡萄糖、阿拉伯糖、D 葡萄糖酸前体等对CTAB浊度法没有干扰,但Mg2+等具有较为明显的干扰。通过冰乙醇沉淀与改良CTAB浊度法的耦合,实现了发酵液中HA含量的高效测定。     

寡聚糖诱导悬浮培养南方红豆衫细胞的凋亡

在真菌（Fusarium oxysporum f.vasinfectum(Atkinson)Snyder et Hansen）寡聚糖诱导悬浮培养南方红豆衫（Taxus chinensis(Pilger)Rehd.var.mairei(Lemee et Levl.）Cheng et L.K.Fu）细胞生产紫杉醇的体系中发现细胞出现凋亡，次生代谢增强，电镜观察到细胞核质和原生质出现凝集现象，液泡内出现大量的高电子致密林。核DNA器发达，但紫杉醇合成速率很低，加入寡聚糖后，细胞防御系统开启，细胞生长停止，次生代谢物酚类物质大量积累且次生壁加厚，多酚氧化酶活性迅速提高，苯丙烷类代谢途径的关键酶苯丙氨酸解氨酶的活性在1h后急速提高，目的产物紫杉醇在诱导后72h达到峰值，比对照组提高了6倍，且细胞凋亡的出现与紫杉醇合成的峰值具有时间上的一致性。