Sirt3对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的保护作用

目的:通过调控骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的Sirtuin-3(Sirt3)蛋白的表达水平,阐明Sirt3对过氧化氢(H2O2)诱导MSCs凋亡的保护作用及其机制。方法:将大鼠MSCs分为正常对照组、H2O2刺激组、H2O2+Sirt3转染组、H2O2+Sirt3 si RNA转染组。利用Western blot法检测Sirt3及cyclophilin d蛋白的表达水平、利用免疫沉淀法检测cyclophilin d乙酰化水平、利用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:1H2O2刺激使MSCs中Sirt3表达水平降低。2转染Sirt3可减少H2O2诱导的MSCs的凋亡,而转染Sirt3 si RNA可增加H2O2诱导的MSCs的凋亡。3Sirt3蛋白的含量并不影响cyclophilin d的表达,但影响cyclophilin d的乙酰化水平。结论:Sirt3可能通过减少线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore,m PTP)中的关键蛋白cyclophilin d的乙酰化水平,进一步抑制m PTP的开放,从而减少H2O2诱导的MSCs的凋亡。     

小鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养及鉴定

目的:建立分离培养小鼠原代主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的方法并检测其生长特性。方法:剥离小鼠主动脉中膜层,分别采用组织块培养法及胶原酶消化法分离培养小鼠主动脉来源的原代VSMC,免疫荧光法检测细胞的纯度和分化状态;3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法测定小鼠主动脉VSMC传代细胞的生长、增殖特性。结果:组织块培养法培养组织块8d后,细胞从组织块边缘爬出,18 d后细胞汇合度达到80%以上后传代;胶原酶消化法分离培养的细胞生长7 d后,汇合度可达80%,此时进行传代;2种方法获得的细胞进行免疫荧光染色,结果显示细胞传至第3代时纯度在95%以上,传至第8代时分化状态并没有改变;MTT法显示细胞生长3~5 d时处于指数生长期。结论:本研究建立了2种可靠稳定的分离和培养小鼠主动脉VSMC的方法,VSMC纯度高,多次传代后细胞特征稳定。     

microRNA499 慢病毒载体转染诱导大鼠骨髓间充质干细胞 向心肌样细胞分化*

目的:探讨microRNA 499(miR-499)慢病毒转染对诱导大鼠骨髓来源间充质干细胞(BM-MSCs)向心肌样细胞分化的作用。方法:取第四代Wistar大鼠骨髓来源间充质干细胞进行流式细胞检测,鉴定干细胞表面特异标记物。使用符合干细胞鉴定标准的细胞批次用于后续实验。实验设置miR499慢病毒转染、慢病毒空白转染2个处理组,分别于处理后即日、1d,3d,5d,7d收集细胞进行下列实验:实时荧光定量PCR检测心肌重要转录因子GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达,western-blot检测心肌特异蛋白I(cTnI)的表达。结果:培养第四代Wistar大鼠骨髓来源间充质干细胞表达干细胞表面特异标记物,可用于实验。大鼠骨髓来源间充质干细胞microRNA 499慢病毒载体转染后microRNA 499表达明显升高,且转染后1d,3d,5d,7d,GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达逐渐增强。慢病毒空白转染组未见明显变化。western-blot检测自第3天开始可见cTnI阳性表达条带,慢病毒空白转染组未检测到明显阳性表达条带。结论:microRNA 499可诱导大鼠骨髓来源间充质干细胞向心肌样细胞分化。