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1.
陶宇  叶婷  费晴如  付晓杰  周育 《微生物学报》1963,(收录汇总):3096-3109
【目的】研究微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)CW117中磷酸吡哆胺氧化酶基因pnpox(phosphopyridoxamine oxidase,pnpox)在维生素B6(VB6)合成中的贡献及对黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)的降解活性。【方法】采用基因插入突变方式,对菌株CW117中磷酸吡哆胺氧化酶基因pnpox进行突变,得到突变菌株。通过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测突变株对AFB1的降解活性,以及突变株中吡哆醇和吡哆醛的合成情况,确定基因pnpox在寡养单胞菌体内VB6合成中的贡献和黄曲霉毒素降解代谢作用。【结果】成功构建了磷酸吡哆胺氧化酶基因突变子pnpox::pK19mobΩ2HMB,突变子吡哆醛的合成量较野生型菌株显著减少,吡哆醇合成量与野生型菌株无显著性差异;同时,突变子与野生型株CW117对AFB1的降解活性未发现显著性差异。【结论】菌株CW117中磷酸吡哆胺氧化酶在吡哆醛合成的过程中起着重要作用,该基因突变会导致VB6的严重缺乏,影响寡养单胞菌正常生长,但该基因对CW117降解黄曲霉毒素无显著性贡献。  相似文献   
2.
武鑫  李萌萌  邓骋  邓威威  张正竹 《广西植物》2016,36(12):1505-1510
咖啡碱和可可碱是茶叶生物碱的主要组分,且咖啡碱是茶叶重要的滋味物质,随着咖啡碱在食品和药物领域的应用愈发广泛,咖啡碱的生物合成成为新的研究热点.目前市场上的咖啡碱主要靠化学合成,为了探索其生物合成途径,该研究将咖啡黄嘌呤核苷甲基转移酶(coffee xanthosine methyltransferase,CaXMT)基因和茶树咖啡碱合成酶(tea caffeine synthase,TCS1)基因的4个突变体分别串联至同一大肠杆菌表达载体pMAL-c5X,诱导融合蛋白共表达,并进行SDS-PAGE凝胶电泳分析.结果表明:目的蛋白成功表达后,应用超声破碎法制备含有目的蛋白的粗酶液,添加底物黄嘌呤核苷(xanthosine,XR)和甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)进行体外酶促反应,将反应产物进行高效液相色谱检测.检测结果显示,pMAL-CaXMT-TM2/3/4的体外酶促反应产物仅有可可碱生成,均未见咖啡碱生成.该研究结果为构建生物合成咖啡碱和可可碱的串联共表达载体奠定了基础,也为进一步研究生物合成咖啡碱和可可碱提供了新思路.  相似文献   
3.
克隆出茶树咖啡碱合成酶基因,对其进行原核表达,并制备TCS1抗体,旨在从蛋白水平研究茶树体内TCS1的表达情况。根据Gen Bank登陆的TCS1基因的全长c DNA序列,找出其完整的ORF(开放阅读框),从茶树叶片c DNA中克隆了TCS1基因的开放阅读框,连接到p GEX-4T-2表达载体,经IPTG诱导表达重组蛋白p GEX-4T-2-TCS1。进行体外酶活检测后,亲和层析纯化重组蛋白,作为抗原免疫家兔,制备TCS1多克隆抗体。用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体的特异性。通过优化诱导条件,得出重组蛋白的最佳表达条件为:30℃、4 h。诱导后的总蛋白、可溶性蛋白与包涵体蛋白均出现一条明显的外源蛋白条带。抗体经ELISA检测,效价为1∶2 000,Western blot检测表明抗体具有相对较好的特异性。构建了TCS1原核表达质粒,同时成功制备了抗TCS1的多克隆抗体。  相似文献   
4.
【目的】茶尺蠖是茶园中的重要害虫。研究茶尺蠖寄主食物-肠道菌群-茶尺蠖生长发育三者之间的关系对于茶尺蠖的防治具有重要的理论指导价值。【方法】分析不添加茶叶因子的纯人工饲料和茶树鲜叶对茶尺蠖幼虫的存活影响;用高通量测序技术分析不同饲料饲喂的茶尺蠖幼虫的肠道菌群异同。【结果】取食人工饲料的幼虫死亡率远远高于取食茶树鲜叶的幼虫;取食人工饲料的幼虫肠道细菌多样性和丰富度高于取食茶树鲜叶的幼虫;茶尺蠖幼虫肠道中存在很多促进宿主生长的细菌。【结论】饲料类型影响茶尺蠖幼虫的存活;饲料类型影响茶尺蠖幼虫肠道菌群结构。  相似文献   
5.
为了解茶树脱水素种类与功能,采用Western-blot技术,研究了不同季节及越冬过程中茶树叶片脱水素蛋白家族的表达模式。结果显示:(1)茶树叶片总蛋白提取采用酚-甲醇/醋酸铵沉淀法,用时短、蛋白浓度高、SDSPAGE电泳条带清晰,背景干净,满足茶树Western-blot技术要求。(2)在不同季节及越冬期中发现14~95kD共9种不同分子量的茶树类脱水素蛋白,其中95、65、48、37、34和14kD等6种蛋白表达量较为稳定,季节与越冬期变化不明显;58kD脱水素仅在冬季表达,越冬期不断上升,2月份增加到最高,表达丰度高;28kD脱水素蛋白在冬季表达量高,越冬期与茶树抗寒力变化规律一致;21kD脱水素在夏季和越冬期后期有较高的表达。研究表明,这3种脱水素可能在茶树抗逆中起着重要作用。  相似文献   
6.
【目的】探究微嗜酸寡养单胞菌中的漆酶对AFB1的降解活性,并确定漆酶在菌株CW117降解代谢AFB1过程中的贡献。【方法】从微嗜酸寡养单胞菌基因组中,共筛选到两个漆酶基因lc1和lc2,并用大肠杆菌BL21外源表达蛋白rLC1和rLC2,在体外检测其对AFB1的降解活性。同时参考前人报道,研究了氧化性辅剂对漆酶AFB1降解的促进作用。在体外实验基础上,利用自杀质粒pK18mobsacB,以同源重组方法构建了两株漆酶缺失株CW117Δlc1和CW117Δlc1-lc2,验证了漆酶基因(lc1和lc2)对AFB1体内降解作用。【结果】体外实验显示,重组酶rLC1具有AFB1降解活性,氧化性辅剂ABTS、AS或SA可显著地提高rLC1降解活性,但rLC2未显示降解活性。突变株CW117Δlc1和CW117Δlc1-lc2对AFB1仍显示了较高的降解活性,且在大多数降解时间点与野生株CW117无显著差异。【结论】微嗜酸寡养单胞菌CW117菌株中,LC1在体外显示了AFB1的降解活性,且降解活性可以被氧化性辅助因子增强,LC2未显示体外降解活性;体内试验发现,漆酶基因lc1和lc2对菌株CW117降解AFB1的贡献较小,该菌株还存在其他降解途径。  相似文献   
7.
为了解茶/油茶嫁接苗叶片在形态和代谢产物上的变化,以茶‘舒茶早’品种(Camellia sinensis ‘Shuchazao’)为接穗,大别山野生油茶(C. oleifera)为砧木进行根颈嫁接,对嫁接体、茶树和油茶的叶片形态和次生代谢产物含量进行了研究。结果表明,茶/油茶嫁接体叶片在形态上更接近于茶,而嫁接体叶片形态学指标却受到了油茶的影响。嫁接体叶片中的氨基酸、嘌呤碱和多酚含量比油茶叶片高,其中茶氨酸含量比油茶显著提高。嫁接体叶片中含有酚酸,而在油茶中未被检出。嫁接体叶片中咖啡碱含量比茶树叶片显著下降。这对茶、油茶的栽培,茶树次级代谢及次级代谢物的转运机理研究具有一定的积极作用。  相似文献   
8.
为探明氮素水平对不同品种茶树的光合系统的影响机制,以‘福鼎大白茶’、‘保靖黄金茶1号’、‘白毫早’两年生茶苗为材料,设置不施氮N_0(0g)、低氮N_1(11g)、中氮N_2(22g)和高氮N_3(33g)4个氮素[(NH_4)_2SO_4]水平的盆栽实验,研究了铵态氮对3个品种茶树的生长势、叶片叶绿素含量、光合参数与叶绿素荧光参数的影响。结果表明:(1)施氮处理能够显著促进茶树的生长,提高茶树叶片叶绿素含量、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr),降低胞间CO_2浓度(Ci),并以N_2处理最好,但水分利用率(WUE)在3个品种茶树间表现不同。(2)在N_2处理下,3个茶树品种的叶片光系统Ⅱ(PSⅡ)暗适应下的最大光化学效率(F_v/F_m)、光化学猝灭系数(qP)、PSⅡ的相对电子传递速率(rETR)亦增加最大,非光化学淬灭系数(NPQ)降低。(3)茶树叶片叶绿素含量与光合参数间存在着一定的联系,并且具有品种特异性。研究发现,适量施氮能够显著增加茶树叶绿素含量、气孔导度、光合活性,从而使得各品种茶树净光合速率增加;氮素水平对各茶树品种的光合及荧光特性影响存在差异,水分利用率亦具有品种特异性;生产中应综合叶绿素含量、光合作用参数、叶绿素荧光参数,可快速、直观地评价不同品种茶树对氮素营养的内在需求,为茶园施肥管理提供指导。  相似文献   
9.
针对NCBI上已登录的茶氨酸合成酶与谷氨酰胺合成酶基因序列进行克隆、原核表达与酶活性验证,利用多种生物信息学数据库和软件,对Cs TS与Cs GS基因进行结构、性质和功能预测,采用同源建模法对蛋白三维结构进行预测,比较并预测催化作用位点的差异;用系统进化树分析从裸子植物到高等被子植物的谷氨酰胺合成酶基因序列,推测其进化的演变过程;通过对原核表达的基因工程菌提取粗酶液进行酶活性测定。结果表明:尽管茶树TS与GS序列高度同源,但是原核表达后的融合蛋白仍然显示了不同的催化能力,蛋白一、二级结构分析显示Cs TS与Cs GS差异不大,但是通过同源建模形成的蛋白三级结构分析显示,Cs TS与Cs GS存在3个催化位点上的差异,这可能是导致其酶活性差异的关键。系统进化分析结果首次确定茶氨酸合成酶应为谷氨酰胺合成酶基因家族成员,按照其细胞定位预测应为胞质型GS,其亲缘关系与同为双子叶植物的葡萄、陆地棉、巴西橡胶树、拟南芥较接近。  相似文献   
10.
在实验室前期构建cDNA幼根文库获得谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS,EC 6.3.1.2)同源序列(contig48)的基础上设计引物,通过SMART RACE技术克隆了该基因cDNA全长序列(命名为GS1-2,GenBank登录号:JQ925873.1)。结果显示:(1)GS1-2基因全长为1 710bp,开放阅读框长1 071bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子质量为39.3kD,理论等电点为5.65;核酸序列分析表明,GS1-2基因与从安吉白茶中克隆的茶氨酸合成酶基因相似性为99%。(2)将GS1-2基因克隆至原核表达载体pET-32a和pMAL-c5x,转化至大肠杆菌,IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE检测结果表明,pET-32a-CsGS1-2转至Rosetta中诱导表达的蛋白与预测蛋白大小一致,主要以包涵体形式存在;而pMAL-c5x-CsGS1-2转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达可产生可溶性蛋白。(3)进一步构建茶树GS1-2酵母表达载体pYES-DEST52-CsGS1-2并转化至酿酒酵母(WAT11)菌液中,添加底物(谷氨酸钠100μmol/L和盐酸乙胺500μmol/L)震荡培养并离心,UPLC-MS测定酶反应产物结果初步表明,目的蛋白不能催化盐酸乙胺和谷氨酸钠合成茶氨酸,但可以合成谷氨酰胺。  相似文献   
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