全基因组重测序揭示青藏高原东缘及东南缘东方蜜蜂遗传多样性与适应性进化

【目的】对青藏高原东缘和东南缘及邻近地区东方蜜蜂Apis cerana样本进行群体遗传多样性与适应性进化研究,为进一步解析青藏高原东方蜜蜂的遗传资源多样性、种群扩散规律以及适应高原生境的分子进化机制提供参考。【方法】对青藏高原东缘和东南缘及邻近地区77群东方蜜蜂样本进行全基因组重测序;运用群体遗传学方法,基于群体结构、主成分分析、系统进化树、遗传分化指数、线粒体基因组单倍型以及选择信号分析对东方蜜蜂这77群及GenBank数据库下载的90群的全基因组重测序原始数据进行分析。【结果】这167群东方蜜蜂区分出来自川西高原、藏南高原、滇北高原和川北高原的4个高原型群,分属于两个进化支,平均遗传分化指数(Fst=0.1178)高于非高原型群的(Fst=0.0411)。基于种群间最小遗传距离分析,东南缘的藏南高原群、滇北高原群与滇南群具有更近的遗传关系;东缘的川西高原群、川北高原群分别与川西山地和秦巴群具有更近的遗传关系。结合线粒体基因组单倍型分析,初步推断出青藏高原东缘及东南缘高原型群体祖先单倍型及来源。选择性分析鉴定到了潜在的参与脂肪酸代谢、光转导、温度适应、卵巢发育等信号通路相关的潜在受选基因。在藏南高原和滇北高原群体中发现两个共同受选择基因ISL-1和FOXO,主要参与胰岛素分泌以应对细胞压力,暗示它们在东方蜜蜂适应青藏高原东南缘生境中发挥着重要作用。【结论】青藏高原东方蜜蜂遗传多样性丰富,东南缘的藏南高原和滇北高原群体以及东缘的川西高原和川北高原群体在遗传分化上明显区分,这4个高原群是由邻近地区非高原群扩散后的地理隔离形成了种群分化;初步筛选获得东方蜜蜂高原环境适应性潜在基因。本研究为进一步探析青藏高原东方蜜蜂适应高原生境下的分子进化机制奠定了基础。     

中华蜜蜂AcNPC2b的原核表达和鉴定

[目的]中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称中蜂),其胞内胆固醇转运体AcNPC2a能够识别并结合几种微生物的细胞壁,AcNPC2存在于该蜂触角,参与嗅觉通讯,关于AcNPC2b的功能尚未见报道.[方法]通过对中华蜜蜂AcNPC2b基因进行原核表达,以纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗血清;利用荧光定量PCR和免疫印迹检测AcNPC2b的转录活性及蛋白水平,通过微生物结合测定对AcNPC2b的功能进行探索.[结果]中蜂AcNPC2b含有信号肽和ML结构域,具有3个二硫键,与果蝇Drosophila melanogaster DmNPC2b聚为一个亚枝.荧光定量qRT-PCR检测发现,感染中蜂囊状幼虫病毒(Chinses sacbrood virus,简称CSBV)的幼虫体内AcNPC2b基因的表达呈现出先微弱下调再持续上调的趋势.获得了约16ku的重组蛋白AcNPC2b并制备了多克隆抗体,免疫印迹结果表明,中蜂AcNPC2b蛋白在工蜂头、胸与中肠中的表达量最高,触角、马氏管与脂肪体中次之.AcNPC2b蛋白在正常与感染CSBV病毒的中蜂幼虫中均有表达,且在感染CSBV的中蜂幼虫中有微弱上调.重组蛋白AcNPC2b微生物结合测定实验结果显示中蜂AcNPC2b重组蛋白均能与活的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌以及白僵菌结合.[结论]正常与感染CSBV病毒的中蜂幼虫体内AcNPC2b基因转录水平和AcNPC2b蛋白的表达含量存在差异,重组蛋白AcNPC2b具有识别并结合病原菌的能力,为后续深入研究AcNPC2b蛋白的分子功能奠定了一定理论基础.     

中华按蚊气味结合蛋白AsinOBP1与避蚊胺(DEET)的结合特性分析

【目的】研究中华按蚊Anopheles sinensis气味结合蛋白1(Asin OBP1)与避蚊胺(N,N-diethylm-toluamide,DEET)的结合特性,并与埃及伊蚊Aedes aegypti Aaeg OBP1、致倦库蚊Culex quinquefasciatus Cqui OBP1进行比较,分析与DEET互作的关键氨基酸残基。【方法】利用原核表达载体进行目的蛋白Asin OBP1的原核表达及纯化。以N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作为荧光探针,通过荧光竞争结合实验对Asin OBP1与DEET的结合特性进行分析,并比较Asin OBP1,Aaeg OBP1和Cqui OBP1与DEET的结合能力,通过分子对接鉴定其与DEET互作的氨基酸残基。【结果】Asin OBP1能与DEET结合,解离常数为29.55μmol/L。在相同实验条件下,Cqui OBP1和Aaeg OBP1都能结合DEET,解离常数分别为17.15和12.81μmol/L。与Aaeg OBP1和Cqui OBP1相比,Asin OBP1结合DEET的能力最弱,Aaeg OBP1最强。分子对接显示,DEET分子结合在Asin OBP1二聚体靠近交界面的结合口袋边缘,结合口袋由α4,α5和α6上的氨基酸残基Leu-92,Leu-95,His-96,Leu-99,Ala-107,Met-108,Met-110,Gly-110,Cys-114,Leu-115,Trp-133,Met-108',Lys-112'和Leu-115'组成。比较分析发现3个蛋白中与DEET甲苯基团形成疏水性作用的氨基酸残基、与DEET羰基氧形成氢键的氨基酸残基是相同的,但与DEET二乙基侧链形成疏水性作用的氨基酸残基中,有一个位置存在差异,Aaeg OBP1是Leu,而Asin OBP1和Cqui OBP1是Met残基。Leu的疏水性强于Met,可能是Aaeg OBP1与DEET的结合能力较强的原因之一。【结论】Asin OBP1能够结合DEET,不同蚊虫气味结合蛋白1与DEET的亲和力存在差异,进一步探索这些差异形成的原因对于阐明气味结合蛋白与DEET互作的模式具有重要的参考价值。     

中国库蚊属四十个种(亚种)的分子系统发育关系研究(双翅目:蚊科)

【目的】对在中国有分布的库蚊属Culex种(亚种)的COⅠ序列和ITS2序列进行测序,构建和讨论这些种(亚种)的分子系统发育关系。【方法】测定了库蚊属20个种(亚种)的COⅠ和ITS2序列,并从NCBI数据库中下载了库蚊属另外20个种(亚种)的COⅠ和3个种(亚种)的ITS2序列。对库蚊属40个种(亚种)的COⅠ序列和其中23个种(亚种)的ITS2序列进行碱基构成、种间遗传距离和饱和度分析,并对COⅠ+ITS2序列进行ILD(incongruence length difference)检验。分别使用2种分子数据集(COⅠ和ITS2)的核苷酸序列,用最大似然法(ML)、贝叶斯法(BI)、邻接法(NJ)和最大简约法(MP)推断这些种的系统发育关系。通过Kishino-Hasegawa(KH)和ShimodairaHasegawa(SH)检验评估这4种系统树间的差异,确定最为合理的系统发育树。【结果】本研究新测序获得20种(亚种)的COⅠ和ITS2序列的长度范围分别为625~685 bp和300~559 bp。COⅠ和ITS2序列在库蚊属成对蚊种间的遗传距离分别是0.002~0.198和0.006~1.807。库蚊属23个种(亚种)的COⅠ+ITS2序列的ILD检验结果显示,数据集具有不相容性,因此COⅠ+ITS2序列不适用于这些种(亚种)的系统发育研究。经KH和SH检验显示,4种系统发育树中,基于COⅠ序列构建的BI树最为合理,而基于ITS2序列构建的MP树最为合理。基于COⅠ核苷酸序列所构建的BI树显示,除幼小库蚊Cx.infantulus和短须库蚊Cx.brevipalpis外,各亚属间成员聚类结果与传统的形态学归类结果吻合;路蚊亚属Lutiza和包蚊亚属Barraudius都归入库蚊亚属Culex内;梅蚊亚属Maillotia和新库蚊亚属Nexoculex聚为一支;库状蚊亚属Culiciomyia、真黑蚊亚属Eumelanomyia和簇角蚊亚属Lophoceramyia均显示为单系。基于ITS2序列所构建的MP树显示,各亚属间和种(亚种)间关系混乱。【结论】重建的分子系统发育树表明库蚊亚属不是一个单系群。在重建库蚊属系统发育关系时,相较于ITS2和COⅠ+ITS2,COⅠ是更为理想的分子标记。本研究构建的分子系统发育关系为中国库蚊属中各亚属和各种(亚种)之间的亲缘关系的研究奠定了基础。     

中华蜜蜂肠粘蛋白AcMucin5AC-1的鉴定和定位分析

【目的】本研究旨在鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana肠粘蛋白AcMucin5AC-1的结构、分布及对中肠的影响,为解析蜜蜂中肠的生理功能提供理论依据。【方法】利用生物信息学比较分析中华蜜蜂AcMucin5AC蛋白的序列特征;利用RT-qPCR检测AcMucin5AC-1在中华蜜蜂4日龄幼虫中肠和表皮以及2日龄幼虫感染中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus, CSBV)后0, 12, 24, 48和72 h时中肠中的表达量。通过原核表达系统对中华蜜蜂AcMucin5AC-1进行表达,亲和层析柱纯化重组蛋白并制备相应多克隆抗体;Western blot检测AcMucin5AC-1在中华蜜蜂健康3-6日龄幼虫中以及4日龄幼虫中肠、表皮和围食膜中的表达,应用间接免疫荧光试验分析AcMucin5AC-1在中华蜜蜂4日龄幼虫中的定位。通过饲喂法利用RNAi沉默中华蜜蜂2日龄幼虫AcMucin5AC-1后12, 24, 48和72 h时分析RNAi干扰效率,利用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色法探究RNAi干扰2日幼虫AcMuc...     

凹唇壁蜂的营巢生物学研究

凹唇壁蜂Osmia excavata Alfken是我国早春果园重要的野生传粉昆虫,具有重要的农业价值.本研究分别在山东烟台、江西赣州和重庆沙坪坝地区利用人工放养滞育状态下的凹唇壁蜂成虫,并通过野外观察和室内解剖该蜂的筑巢巢管,系统研究了该蜂的筑巢习性、访花行为、日活动规律和生活史等营巢生物学及相关生物学特性.结果表明...     

大分舌蜂不同龄期幼虫及滞育预蛹肠道细菌 群落多样性及其差异

【目的】基于昆虫肠道微生物在宿主健康与调控宿主生长发育中发挥着重要作用,本研究旨在对大分舌蜂Colleles gigas不同龄期幼虫及滞育预蛹肠道细菌群落多样性及其差异进行初步探究。【方法】利用野外采集的大分舌蜂1-5龄幼虫及滞育预蛹,提取肠道内容物细菌DNA进行16S rRNA的V3-V4基因片段PCR扩增,利用IlluminaMiseq二代高通量测序技术进行测序。依据获得的序列数据,利用生物信息学方法分析大分舌蜂幼虫和滞育预蛹肠道细菌的组成、丰度和多样性。【结果】大分舌蜂幼虫肠道细菌菌群共检测到15门,23纲,43目,80科,128属的细菌,其中最主要的门是变形菌门(Proteobacteria)(占93.74%),最主要的目是立克次氏体目(Rickettsiales)(占68.68%),最主要的科是无形体科(Anaplasmataceae)(占68.64%),最主要的属是沃尔巴克氏体属Wolbachia(占68.64%)。Beta多样性分析结果显示,细菌群落变化与幼虫发育有关,显示出低龄组(1-3龄幼虫)、高龄组(4-5龄幼虫)和滞育预蛹组3个水平。Alpha多样性分析显示,滞育预蛹组细菌多样性与高龄组和低龄组的存在显著差异,而高龄组与低龄组间差异不显著。线性判别分析结果显示,滞育预蛹组与低龄组都存在显著优势菌纲,分别是α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和γ 变形菌纲(Gammaproteobacteria),而高龄组不存在显著优势纲。在目水平,肠杆菌目(Enterobacteriales)和假单胞菌目(Pseudomonadales)为低龄组优势目,立克次氏体目(Rickettsiales)为滞育预蛹组的优势目。在科水平,肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和莫拉氏菌科(Moraxellaceae)为低龄组的优势科,无形体科(Anaplasmataceae)为滞育预蛹组的优势科。在属水平,低龄组优势属为肠杆菌属 Enterobacter和不动杆菌属Acinetobacter,滞育预蛹组优势属为沃尔巴克氏体属 Wolbachia。功能基因注释结果也显示出这3个组的特点。【结论】大分舌蜂不同龄期幼虫及滞育预蛹肠道细菌群落存在显著差异,从低龄组向高龄组再到滞育预蛹组,细菌多样性逐步降低,这可能与其进食特点以及肠道微生物驱动对肠道环境适应有关。本研究为土壤筑巢独栖野生蜜蜂肠道微生物研究奠定基础,也为此类野生蜜蜂的保护提供新的角度与方向。     

中华按蚊OCT家族基因的多样性及序列特征

【目的】在全基因组水平鉴定、分类和命名中华按蚊Anopheles sinensis有机阳离子转运体(organic cation transporter, OCT)家族基因,为昆虫OCT基因提供信息框架。【方法】从NCBI, VectorBase和EMBL数据库下载冈比亚按蚊An. gambiae、黑腹果蝇Drosophila melanogaster和秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans已知的OCT氨基酸序列作为询问序列,基于中华按蚊基因组与转录组测序数据,通过本地Blast搜索鉴定中华按蚊基因组上OCT基因;运用生物信息学方法预测中华按蚊OCT基因的基因结构、Scaffold定位和保守基序等特征,通过最大似然法构建中华按蚊OCT基因的系统发育树。【结果】中华按蚊共有54个OCT家族基因,分属于OCTA, OCTB和OCTC 3个亚家族,分别有33, 15和6个基因。除AsOCTA20和AsOCTB2外,其余OCT基因编码的氨基酸序列均具有MFS_1和Sugar_tr跨膜结构域(transmembrane domain, TMD),大多数OCT氨基酸序列有12个TMD。所有OCT氨基酸序列都有GRK-(PT)-VL, PES-(APVS)和EQFPT-(VI)-RN 3个保守基序,各亚家族还有各自的保守基序。4对基因(AsOCTB4a和AsOCTB4b, AsOCTA10a和AsOCTA10b, AsOCTA19a和AsOCTA19b,以及AsOCTA23a和AsOCTA23b)源自基因重复事件。AsOCTC基因较为原始,AsOCTB基因较为进化,都是明显的单系; AsOCTA基因介于两者之间,进化关系较为复杂。【结论】本研究丰富了中华按蚊基因组数据,为后续中华按蚊OCT基因功能特别是杀虫剂抗性机制方面的功能研究奠定了基础。     

基于DNA条形码的白斑切叶蜂粉源植物种类及多样性分析

利用人工蜂巢收集白斑切叶蜂(Megachile strupigera)蜂粮样本,并通过克隆测序方法,比较分析了新余市水北镇(XYSB)、吉安市戈坪乡(JAGP)、赣州市沙地镇(GZSD)和赣州市齐云山自然保护区(GZQYS)的4种不同林地类型的白斑切叶蜂粉源植物组成及多样性。共鉴定出粉源植物9科10属15种。其中黄荆Vitex negundo和山牡荆Vitex quinata为优势种。Chao1指数、Shannon-wiener指数和Simpson指数分析结果表明,4个样地粉源植物的丰富度和多样性依次为GZQYSGZSDXYSBJAGP。并且,4个样地七月上旬的物种丰富度均明显高于八月中旬。同一时期的粉源植物种类及多样性存在显著差异,表明不同林地利用方式对白斑切叶蜂粉源植物多样性的影响非常明显,并随人为干扰程度的增高而降低。相同样地中2个不同时期均呈现出粉源植物多样性随花期变化而降低的趋势,但其主要粉源植物种类没有发生改变,表明该蜂主要粉源植物没有受到花期变化的影响。因此,黄荆和山牡荆是白斑切叶蜂的主要粉源植物,对维持白斑切叶蜂种群的稳定具有重要作用。     

林氏按蚊线粒体全基因组序列的测定及基于线粒体基因组的按蚊属系统发育分析(英文)

【目的】对林氏按蚊Anopheles lindesayi完整的线粒体基因组进行测序及分析,依据已知的线粒体基因组构建并讨论按蚊属蚊虫的分子系统发育关系。【方法】对林氏按蚊线粒体基因组进行测序、注释,并对其基本特征和基本组成进行分析。基于串联的13个蛋白质编码基因的核苷酸序列和氨基酸序列,用ML法和贝叶斯法构建林氏按蚊和按蚊属其他32种蚊虫的系统发育树,据此探讨按蚊属蚊虫的系统发育关系和系统分类。【结果】林氏按蚊线粒体基因组全长为15 366 bp,包含13个蛋白质编码基因,22个tRNA基因,2个rRNA基因和一段控制区。林氏按蚊线粒体基因组呈现明显的AT偏斜和GC偏斜,AT偏斜为正,GC偏斜为负。除了COX1使用TCG和ND5使用GTG作为起始密码子以外,其他蛋白质编码基因的起始密码子均遵循ATN原则;终止密码子为TAA或者T。除了tRNA^Ser(AGN)以外,其他的tRNA基因均呈现典型的三叶草二级结构。控制区AT含量最高,为94.54%。滑窗分析显示蛋白质编码基因是用于构建亚属或属水平系统发育关系的最佳分子标记。系统发育树强烈支持塞蚊亚属Cellia、按蚊亚属Anopheles、徕蚊亚属Nyssorhynchus和柯特蚊亚属Kerteszia均为单系群。小五斑按蚊An. atroparvus和四斑按蚊An. quadrimaculatus A这两个种聚到一起,从传统的形态分类上讲,它们和林氏按蚊均属于按蚊亚属按蚊系蚊虫。但本研究构建的4个系统发育树均显示,(小五斑按蚊An. atroparvus+四斑按蚊An. quadrimaculatus A)和林氏按蚊被属于迈蚊系的中华按蚊分开,这为两个系的分类提供了新的论点。【结论】本研究获得了林氏按蚊的完整的线粒体基因组,探析了按蚊属的线粒体基因组特征和系统发育关系,为进一步研究蚊科线粒体基因组和系统发育关系提供了依据。