苹果柠檬酸合酶3基因家族成员鉴定及表达分析

柠檬酸合酶(citrate synthase 3, CS3)是细胞代谢途径中的关键酶之一,其活性调节着生物体的物质和能量代谢过程。本研究旨在从苹果全基因组中鉴定CS3基因家族成员,并进行生物信息学和表达模式分析,为研究苹果CS3基因的潜在功能提供理论基础。利用BLASTp基于GDR数据库鉴定苹果CS3家族成员,通过Pfam、SMART、MEGA5.0、clustalx.exe、ExPASy Proteomics Server、MEGAX、SOPMA、MEME和WoLF PSORT等软件分析CS3蛋白序列基本信息、亚细胞定位情况、结构域组成、系统进化关系以及染色体定位情况。利用酸含量的测定和实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)技术检测苹果6个CS3的组织表达和诱导表达特性。苹果CS3基因家族包含6个成员,这些CS3蛋白包括473−608个不等的氨基酸残基,等电点分布在7.21−8.82。亚细胞定位结果显示CS3蛋白分别定位在线粒体和叶绿体。系统进化分析可将其分为3类,各亚家族基因数量分别为2个。染色体定位结果显示,CS3基因分布在苹果不同的染色体上。蛋白二级结构以a-螺旋为主,其次是无规则卷曲,b-转角所占比例最小。筛选的6个家族成员在不同苹果组织中均有表达,整体表达趋势从高到低依次为MdCS3.4相对表达含量最高,MdCS3.6次之,其他家族成员相对表达量依次为MdCS3.3>MdCS3.2>MdCS3.1>MdCS3.5。qRT-PCR结果显示,MdCS3.1和MdCS3.3基因在酸含量较低的‘成纪1号’果肉中相对表达量最高,酸含量较高的‘艾斯达’果肉中MdCS3.2和MdCS3.3基因相对表达量最高。因此,本研究对不同苹果品种中CS3基因相对表达量进行了检测,并分析了其在苹果果实酸合成过程中的作用。结果表明,CS3基因在不同苹果品种中的相对表达量存在差异,为后续研究苹果品质形成机制提供了参考。     

山黧豆活性成分β-ODAP的检测方法研究进展北大核心CSCD

β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid,β-ODAP)是山黧豆中的一种重要非蛋白氨基酸,与三七中的三七素为同一种次生代谢物,具有止血、兴奋神经、抗菌等多种生物活性。自20世纪60年代和80年代在山黧豆等豆类和三七等植物中分别发现β-ODAP以来,科研工作者建立了多种检测方法。该文对近年来国内外有关检测β-ODAP的传统分析法、高效液相色谱法(HPLC)、色谱-质谱法(GC/LC-MS)、毛细管电泳法及酶学分析法等的基本原理及应用研究进展进行了综述,这些检测方法各有所长,具体选择依实验条件和实验目的而定。其中,柱前衍生化高效液相色谱法是目前应用最广泛的方法,高成本同位素内标的LC-MS则被誉为“金标准”。但特异、快速和低成本的检测方法一直是人们的追求目标,因而进一步完善酶传感器技术是β-ODAP检测领域在将来的主要研究方向。     

甘肃省大豆品种生育期组的划分及地理分布研究

甘肃省地域广大,地形复杂,气候多样,大豆品种资源丰富,但甘肃各地大豆品种生育期生态类型并不明确。本试验以25份MG 0~Ⅴ的北美大豆生育期组标准品种为对照,将从甘肃各地收集到的151个大豆品种在甘肃境内5个生态区进行生育期性状鉴定和生育期组划分。结果表明,甘肃地区种植的大豆品种的生育期组在MG 00和MGⅥ之间。在所鉴定的品种中,属MGⅣ的比例(44.37%)最高,其次为MGⅤ(29.14%)、MGⅢ(11.26%)、MGⅡ(4.64%)、MG 0(3.31%)、MGⅥ(3.31%)、MG 00(2.65%)和MGⅠ(1.32%)。归属于MGⅢ的品种主要分布在河西灌区,占该区域参试品种总数的47.62%;归属于MGⅣ的品种主要分布在中部地区和陇东旱塬区,占中部地区参试品种总数的56.67%,占陇东旱塬区的63.83%;归属于MGⅤ的品种主要分布在陇南地区,占该区域参试品种总数的61.40%。根据甘肃不同地区可成熟的最晚熟大豆品种的生育期组与当地经度、无霜期建立回归方程,推断甘肃省大豆各生育期组的地理分布区间,提出了基于生育期组的甘肃省大豆品种引种方案,以期为甘肃地区大豆育种和品种布局提供科学依据。     

三七素检测方法研究进展

三七素是中药三七的止血活性成分,也存在于山黧豆等植物中,称山黧豆神经毒素,其化学成分为β-N-草酰-L-α,p二氨基丙酸,属非蛋白游离氨基酸.本文从传统氨基酸分析、气相、液相色谱及其色谱-质谱联用、毛细管区带电泳、流动注射等方面综述了三七素的分析检测方法,并对相关技术进行了评述,为合理选择三七素检测手段提供参考.     

山黧豆β 腈基丙氨酸合成酶基因LsCAS的原核表达及蛋白聚合状态分析

该研究从山黧豆种子萌发6 d后的幼苗根中扩增到β 腈基丙氨酸合成酶基因(LsCAS)的CDS序列,并构建pGEX2T LsCAS表达载体;经诱导表达后,通过GST亲和层析进行LsCAS蛋白纯化,并利用GST标签抗体和大豆半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase,CS)抗体对纯化蛋白进行Western blot验证;纯化后的LsCAS蛋白经凝血酶切除GST标签抗体后,利用凝胶过滤预装柱Superdex 200 Increase 10/300 GL分析判断分子量。结果显示：(1)山黧豆LsCAS基因的CDS序列为1 035 bp,编码344个氨基酸;其编码的蛋白质具有典型的CBS like 蛋白功能结构域胱硫醚β 合酶(CBS)和半胱氨酸合成酶(CS)。(2)成功构建LsCAS基因的原核表达载体pGEX2T LsCAS并进行蛋白纯化;SDS PAGE检测表明,所获融合蛋白条带单一,大小在64 kD左右;Western blot分析发现,诱导后的菌体蛋白和纯化后的重组蛋白中均能检测到特征条带,说明所获融合蛋白为山黧豆LsCAS蛋白。(3)纯化的山黧豆LsCAS蛋白在412 nm的特征吸收峰显示,LsCAS隶属于磷酸吡哆醛(PLP)依赖的半胱氨酸合成酶家族;分子排阻试验证实山黧豆LsCAS为PLP依赖性蛋白酶,可能以四聚体方式发挥作用。研究结果为进一步探讨山黧豆LsCAS的调控及其功能奠定了基础。     

矮嵩草草甸主要植物不同器官对氮素的吸收及分配特征研究

以高寒矮嵩草(Kobresia humilis)草甸7个主要植物种为研究对象,利用15 N同位素标记技术,通过分析不同器官对氮素的吸收及分配特征,揭示主要植物种在群落中的生态适应性、竞争力和地位。结果显示:(1)矮嵩草的叶和茎、垂穗披碱草(Elymus nutans)的叶,以及双柱头藨草(Scirpus distigmaticus)和鹅绒委陵菜(Potentilla anserina)的叶、茎、根均偏好累积硝态氮,早熟禾(Poa annua)的穗和叶以及甘肃马先蒿(Pedicularis kansuensis)和短穗兔耳草(Lagotis brachystachya)的根均偏好积累铵态氮。(2)矮嵩草对吸收的甘氨酸和硝态氮主要分配于叶中,铵态氮分配于茎中;双柱头藨草对吸收的甘氨酸和硝态氮主要分配于茎中,铵态氮分配于叶中;垂穗披碱草和早熟禾对吸收的硝态氮和铵态氮主要分配于叶中;垂穗披碱草对吸收的甘氨酸主要分配于根中,而早熟禾将较多的甘氨酸分配到穗中;甘肃马先蒿对吸收的硝态氮主要分配于叶中,铵态氮分配于根中;鹅绒委陵菜对吸收的甘氨酸、硝态氮和铵态氮主要分配于叶中;短穗兔耳草对吸收的甘氨酸主要分配于叶中,硝态氮和铵态氮主要分配于根中。(3)在牧草生长盛期,矮嵩草草甸土壤的有机氮和无机氮主要贡献于甘肃马先蒿的花、早熟禾的穗、垂穗披碱草的根和鹅绒委陵菜的茎叶。研究表明,高寒矮嵩草草甸主要植物不同器官对氮素的吸收及分配呈现多元化特征,因不同植物种的生物学特性和生态适应习性而异。     

拟南芥乙酰羟酸合成酶(AHAS)点突变原核表达与活性测定

拟南芥乙酰羟酸合成酶(AHAS)参与支链氨基酸合成。为考察AHAS不同结构域对支链氨基酸合成的影响,分别对其大小亚基上特定位点进行点突变后进行原核表达,体外重组后对其全酶活性进行测定,并对其终端产物之一——缬氨酸对AHAS全酶活性的影响进行探讨。结果显示:AHAS小亚基G88D突变将解除其终端产物的反馈抑制作用,而大亚基E305D与E482D的突变降低AHAS全酶活性,且2种不同突变大亚基对AHAS全酶活性影响存在差异。AHAS大亚基E482D突变较E305D突变影响更大。研究结果表明:AHAS大小亚基间存在着相互作用,且大小亚基不同结构域突变对AHAS全酶活性具有不同的影响。     

拟南芥AtJ3通过核质转运调控植物质膜H~+-ATPase活性与ABA响应

拟南芥AtJ3(Arabidopsis thaliana Dna J homolog 3)为一蛋白分子伴侣,在植物体内可通过与PKS5(SOS2-like protein kinase 5)蛋白激酶形成复合物来抑制PKS5的活性;同时AtJ3-PKS5复合物可对质膜上H~+-ATPase质子转运活性进行正向调节,并参与对外源ABA的响应。为揭示AtJ3-PKS5复合物参与质膜H~+-ATPase活性调节及对外源ABA响应中的作用,本研究以拟南芥AtJ3、PKS5不同突变体为材料,在盐及ABA共同处理下对AtJ3-PKS5复合物的功能及作用机制进行了探讨。结果显示,在2种因素共同处理下,AtJ3-PKS5复合物可同时对处理因素进行响应。即AtJ3-PKS5复合物可对质膜上H~+-ATPase质子转运活性进行调节,并使细胞内p H值发生变化,同时还可诱导ABI5下游ABA响应基因的表达;外源ABA可引起AtJ3从细胞核向细胞质的转运,从而增强了AtJ3对H~+-ATPase活性的调节。说明AtJ3-PKS5复合物在对H~+-ATPase活性调节及对外源ABA响应的交互代谢途径中起着关键调节子的作用。     

半胱氨酸合成酶与β-氰基丙氨酸合成酶活性检测

植物半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase,CSase)和β-氰基丙氨酸合成酶(β-cyanoalanine synthase,β-CAS)分别催化合成半胱氨酸(Cysteine,Cys)和β-氰基丙氨酸(β-Cyanoalanine,β-CA),它们在功能上冗余。本研究以山黧豆、苜蓿和玉米为主要材料,结合电泳对8种常见植物CSase和β-CAS粗酶活性进行了分析。结果表明,检测CSase活性时,8种植物两类粗酶的最适反应时间均为10min,最适pH均为8.0,底物O-乙酰-丝氨酸和Na2S最适浓度分别是10和5 mmol·L-1。检测β-CAS活性时,8种植物两类粗酶的最适反应时间均为30min,最适pH均在9~10范围内,底物Cys最适浓度均为3mmol·L-1,而底物KCN最适浓度前者为80mmol·L-1,后者为3mmol·L-1。8种植物中,CSase活性在种、种内组织间差别不是很大,但β-CAS活性则相反,尤其在茎叶和根中差别较大。     

甘肃省麦积山景区3种典型裸子植物土壤微生物群落结构分析

【目的】探明不同种类的植物对其根际土壤微生物数量分布与群落结构的影响。【方法】将微生物计数法与磷脂脂肪酸(PLFA)法相结合,分析比较麦积山景区3种典型裸子植物根际土壤微生物的数量分布和PLFA种类、含量及主成分结构。【结果】3种植物根际土壤微生物数量均以细菌最多,真菌最少;总PLFA含量以红豆杉[Taxus chinensis(Pilg)Rehder.]最高、种类最多,日本落叶松[Larix kaempferi(Lamb)Carriere.]最低,红豆杉与云杉(Picea asperata Mast)PLFA主要成分相似度高于日本落叶松;外来种日本落叶松无论微生物数量,还是种类以及PLFA结构组成与红豆杉、云杉均有较大的差异,多样性显著下降。【结论】与土著裸子植物相比,外来种日本落叶松能明显改变根际土壤微生物数量分布与群落结构。