改良胶原酶消化法分离培养人原代髓核细胞

目的:优化人原代髓核细胞的体外分离培养方法,为椎间盘退变的防治研究提供种子细胞。方法:无菌环境中摘取人椎间盘髓核组织,采用多次胶原酶消化法分离提取原代人髓核细胞,置于5%CO2培养箱中37℃恒温培养,倒置相差显微镜中观察细胞形态,采用MTT法绘制细胞生长曲线,甲苯胺蓝染色法检测髓核细胞内蛋白多糖的表达情况,细胞免疫荧光染色法检测Ⅱ型胶原蛋白表达情况。结果:本研究中获得的细胞形态不规则,呈梭形或多角形,原代细胞48 h内贴壁,培养第8天左右细胞融合度可达90%,第三代细胞12 h内即可贴壁,生长至融合90%约需5d。甲苯胺蓝染色及细胞免疫荧光染色均阳性,提示所得细胞具有分泌蛋白多糖及Ⅱ型胶原蛋白的功能。结论:改良胶原酶消化法可获得大量纯净的人髓核细胞,提高培养效率,原代及传代细胞具备类软骨细胞表型,且活性及功能均较为稳定,可作为椎间盘组织工程研究的种子细胞。