红火蚁Toll受体家族免疫响应绿僵菌表达模式的研究

为探究红火蚁Solenopsis invicta Buren Toll受体家族基因如何免疫响应绿僵菌Metarhizium的侵染。本研究采用浸渍法测定了不同浓度下绿僵菌对红火蚁大中小3种不同大小工蚁的致病力,并用显微镜观察了绿僵菌侵染后红火蚁3种工蚁的表型变化。利用生物信息学筛选Toll受体基因,并对Toll受体家族基因的理化性质、结构域、染色体位置、系统进化进行分析鉴定。运用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测了红火蚁大中小型工蚁中Toll受体家族的发育历期和绿僵菌侵染后的表达模式。结果表明,绿僵菌在96 h对红火蚁大中小型工蚁的致死中浓度（LC50）分别为5.8×10^7孢子/mL、3.1×10^7孢子/mL、1.5×10^7孢子/mL;绿僵菌侵染红火蚁第3天,显微镜下观察到红火蚁体壁细小的菌丝,虫体僵硬,寄主死亡后菌丝迅速蔓延并逐渐长成橄榄绿色分生孢子;RT-qPCR结果表明Toll受体基因在红火蚁不同发育阶段中的mRNA表达水平存在显著差异,且Toll受体基因在雌性生殖蚁表达水平显著高于雄性生殖蚁;RT-qPCR结果表明红火蚁大中小型工蚁Toll受体免疫响应绿僵菌不一样。在大型工蚁中,绿僵菌侵染后,Toll受体家族基因能显著上调表达,6 h是一个诱导高峰期,Toll2-1和LRR转录水平最高,响应绿僵菌最强;在中型工蚁中,绿僵菌不能刺激Toll2-2基因的表达,却能强烈诱导Toll1,Toll2-1,Toll6,Toll7和LRR基因的上调表达,Toll1和Toll2-1响应绿僵菌最强。在小型工蚁中,绿僵菌能显著诱导Toll受体家族基因基因的上调表达,在24 h时,LRR基因表达量最高,相比于对照,LRR基因表达提高25倍,LRR在6 h和24 h响应绿僵菌最强。以上研究表明Toll受体可以免疫响应入侵的绿僵菌,且不同的Toll对绿僵菌可能具有不同的响应机制。本研究为进一步阐明Toll受体的功能奠定基础,为进一步利用绿僵菌控制红火蚁提供技术指导。     

红火蚁Serpin家族基因鉴定及其在绿僵菌侵染下的表达模式分析

丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine protease inhibitor, Serpin）在昆虫Toll通路和PPO级联反应的防御机制中起着至关重要的作用。本研究利用现代生物信息学工具预测和分析了红火蚁Solenopsis invicta中Serpin家族的结构和功能多样性。染色体定位表明,红火蚁基因组中7个Serpin基因家族成员不均匀的分布在4条染色体上。结构域分析表明,SiSerpin蛋白具有Serpin基因的保守结构,即典型的反应中心环（Reactive central loop, RCL）结构与Serpin结构域,不同成员蛋白拥有多样化的基序。系统进化分析表明,红火蚁Serpin蛋白与其他的昆虫Serpin蛋白有较高亲缘关系,SiSerpin7与烟草天蛾Manduca sexta的Serpin3a亲缘关系最近,SiSerpin12与黄粉虫Tenebrio molitor Serpin55亲缘关系最近,SiSerpin13与烟草天蛾Serpin6亲缘关系最近,SiSerpin4与家蚕Serpin27亲缘关系最近。为了进一步明确红火蚁Serpin家族在绿僵菌Metarhizium侵染后的表达模式,用绿僵菌侵染不同体型的工蚁,荧光定量PCR（RT-qPCR）分析表明,红火蚁Serpin基因家族成员能在早期响应绿僵菌的侵染;除SiSerpin7基因外,大型和小型两种工蚁的表达模式存在较大的差异。结果表明红火蚁Serpin家族作为免疫调控蛋白,能够响应绿僵菌的侵染,且在红火蚁不同体型工蚁之间存在着不同的免疫调控模式。这些发现不仅为Serpins的功能分析提供了理论基础,而且有可能有助于绿僵菌作为一种有效的生防剂的开发。