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1.
根据羰基还原酶催化可逆氧化还原反应的原理,利用与偶氮还原酶催化偶氮染料还原反应耦合的颜色变化,建立了一种新的羰基还原酶筛选方法。由于羰基还原酶在催化醇底物氧化反应时会产生NAD(P)H,当在反应体系中加入偶氮还原酶AzoB和偶氮染料金橙Ⅰ的时候,偶氮还原酶可以利用NAD(P)H作为电子的供体与底物金橙Ⅰ发生反应,导致反应体系颜色的变化,这样就能够根据明显的颜色变化推断出该羰基还原酶是否对所选底物表现出特定的活性,进而可以筛选出有活性的羰基还原酶。同时,使用不同构型的手性醇作为底物时,根据体系的颜色变化,可以实现羰基还原酶的活性和立体选择性的同时筛选。  相似文献
2.
卤醇脱卤酶 (Halohydrin dehalogenase) 不仅对于含氯污染物的生物降解、净化环境具有重要意义,而且在手性医药中间体合成中也是一种重要的生物催化剂,但其数量较少。采用基因挖掘在基因组数据库中获得一种来自运动替斯崔纳菌Tistrella mobilis KA081020-065的新型卤醇脱卤酶基因HheTM,将该基因克隆、表达在大肠杆菌BL21(DE3)中,利用镍柱亲和层析将该酶进行纯化并研究了其酶学性质。HheTM是一种同源四聚体;最适温度为50 ℃;不同的 pH 缓冲液对其活性有较大影响;在碱性、30 ℃以下的条件下稳定性高。在氰根离子存在的条件下,HheTM能够催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯,为酶法合成阿托伐他汀关键中间体提供了一种新的卤醇脱卤酶。  相似文献
3.
辅酶NAD(H) 相比NADP(H) 有稳定性好、价格低廉及更广的辅酶循环方法等优势,因此在实际应用中常需将NADP(H) 赖型的脱氢酶改造成为NAD(H) 依赖型的。来源于嗜热共生杆菌Symbiobacterium thermophilum的NADP(H) 依赖型内消旋-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶 (meso-2,6-diaminopimelate dehydrogenase, StDAPDH) 及其突变体酶是催化还原氨化合成D-氨基酸的优良催化剂,本研究试图改变其辅酶偏好性,增强其应用优势。对其晶体结构分析可知,氨基酸残基Y76距离腺嘌呤较近,R35及R36和辅酶上磷酸基团有直接相互作用。依氨基酸侧链基团性质对Y76进行了定点突变,发现不同突变子对两种辅酶的偏好性都发生了变化;对与磷酸基团直接作用的R35、R36进行的双突变R35S/R36V,导致酶对NADP+的催化活力降低;将R35S/R36V和部分Y76突变进行了组合,发现三突变组合以NAD+为辅酶时的活力均大于以NADP+为辅酶的活力,实现了辅酶偏好性转变。这些研究工作为进一步实现StDAPDH的辅酶偏好性完全转变提供依据。  相似文献
4.
【目的】研究来源于瘤胃菌Ruminococcus sp.的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的底物结合机制。【方法】通过同源模拟和同源序列比对,筛选与其底物结合相关的关键位点,进而通过定点突变构建突变体并对其动力学性质进行研究。【结果】筛选得到关键位点Y6和A109,构建了突变体Y6F、Y6I、A109P及A109L。【结论】Y6既与底物结合又与催化能力相关,其?OH只与底物结合相关,芳香环则与催化能力和结合能力均相关;而A109则只是底物结合的位点。该研究结果为D-阿洛酮糖3-差向异构酶的催化机理研究及分子改造提供了借鉴。  相似文献
5.
耐热的木聚糖酶具有用于造纸、麻类脱胶和饲料生产等工业领域的巨大潜力,为了提高11家族碱性木聚糖酶Xyn11A-LC的热稳定性,通过理性设计在N-末端引入了芳香族氨基酸(T9Y和D14F)。测定野生型和突变体的性质表明,突变体的最适反应温度和热稳定性均获得了提高。突变体的最适反应温度比野生型提高了5℃。野生型在65℃的Tris/HCl缓冲液(pH 8.0)中的半衰期为22 min,而突变体在此条件下的半衰期为106 min。圆二色光谱测定结果显示野生型和突变体的Tm分别为55.3℃和67.9℃。因此,通过在N-末端引入芳香族氨基酸可以提高11家族木聚糖酶的热稳定性和在高温下的活性。  相似文献
6.
由于二芳香基甲酮的位阻大及羰基两侧的取代基差异性较小,对其进行不对称还原是生物催化中具有挑战性的难题之一.文中通过对毕赤酵母GSl15基因组序列的分析,发现了一个潜在羰基还原酶基因pascr.将该基因克隆、表达在大肠杆菌Rosetta2 (DE3)中,通过Ni-NTA对重组蛋白进行了分离纯化,并对酶的性质进行了研究.PasCR专一性利用NADPH作为辅酶,其最适反应pH为6.5;最适反应温度为35℃;凝胶层析实验结合SDS-PAGE分析表明PasCR在溶液中以二聚体形式存在.PasCR能够不对称还原位阻较大的二芳香基甲酮类化合物,如4-甲基二苯甲酮、4-氯二苯甲酮、2-氯二苯甲酮等,对4-甲基二苯甲酮的还原产物的ee值达到了85%.  相似文献
7.
研究了利用生物催化剂制备(S)-4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸.以3-(4-氯苯基)-戊二腈为底物,采用苯酚-次氯酸钠法对实验室保藏的菌株进行筛选,得到一株产物立体选择性较高的菌株赤霉菌Gibberella intermedia WX12,并对其催化特性和发酵条件进行了初步研究.以30 g/L的乳糖和20 g/L的蛋白胨分别为碳、氮源,发酵培养96 h,收集的菌体在50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 8.0)中30℃催化反应24 h,将3-(4-氯苯基)-戊二腈转化为4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸,产率为90%.将产物化学转化为巴氯芬,手性HPLC分析表明水解产物构型是(S),其对映异构体过量值ee> 99%.该产物可以用来合成光学纯的(R)-和(S)-巴氯芬.  相似文献
8.
手性醇是一类非常重要的化合物,羰基还原酶催化酮的不对称还原生成对应的手性醇.从毕赤酵母Pichia pastoris GS115基因组数据中找到一个潜在的NADPH依赖的羰基还原酶,研究毕赤酵母 P.pastoris GS115中的羰基还原酶.根据其核酸序列设计引物,从P.pastoris GS115基因组中扩增到目的基因ppcr,大肠杆菌BL21 (DE3)中表达,Ni-NTA纯化,对酶的性质和底物谱进行了研究.PPCR的最适反应温度为35℃,最适反应pH为6.0,低于45℃时有很好的稳定性.对3-甲基-2-羰基丁酸乙酯的Km和kcat分别为9.48 mmol/L和0.12 s-1. PPCR表现出广泛的底物谱和很高的对映选择性,对醛、α-酮酯、芳香族β-酮酯及芳香族酮都表现出了很好的活性,在测定的底物中,除极少数底物外,ee值均达到97%以上.因此,PPCR具有较好的应用前景.  相似文献
9.
葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal(GenBank Accession No.EFS20452.1)构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达.通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现,ShNAL是一个四聚体,裂解方向的最适反应pH为8.0;合成方向的最适反应pH为7.5,最适反应温度为45℃.在45℃下孵育2h对ShNAL的活力基本无影响,高于45℃时,活力迅速下降.该酶在pH 5.0~10.0的环境中比较稳定,4℃下放置24 h酶的残余活力在70%以上.ShNAL对N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(Man)和丙酮酸(Pyr)的Km值分别是(4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1)mmol/L和(35.14±3.2) mmol/L,kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s)和0.08 L/(mmol·s).  相似文献
10.
ω-转氨酶 (ω-transaminase) 可以通过手性拆分和不对称合成的催化反应来获得光学纯的手性胺类化合物和非天然氨基酸,在医药中间体合成中是一种重要的生物催化剂。采用基因挖掘技术,在基因组数据库中获得一个来自伯克氏菌Burkholderia phytofirmans PsJN的ω-转氨酶基因 (hbp),将该基因在大肠杆菌BL21 (DE3) 中克隆、表达,利用镍柱亲和层析将该酶 (HBP) 进行纯化并研究了其酶学性质和底物谱。结果表明,以β-苯丙氨酸 (β-Phe) 为氨基供体、丙酮酸为氨基受体,HBP具有较高的活力 (32.47 U/mg) 和立体选择性;其最适温度为40 ℃左右,最适pH在8.0–8.5之间。研究过程中,建立了一种简便快捷的紫外吸收法来检测β-Phe的脱氨反应,证明了该反应的热力学平衡性质。底物谱研究表明HBP可以以β-Phe及其衍生物为氨基供体。结果表明HBP能够有效地手性拆分rac-β-Phe及其衍生物,转化率在50%左右,ee>99%。  相似文献
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