Ghrelin在绵羊体内卵母细胞和早期胚胎的表达

为了明确ghrelin是否参与了卵母细胞成熟及胚胎早期发育进程,本研究利用免疫荧光技术和实时定量RT-PCR技术检测了绵羊卵母细胞和体内早期胚胎中ghrelin蛋白的表达定位和ghrelin mRNA水平相对表达变化规律。免疫荧光染色结果表明,ghrelin蛋白主要分布于卵母细胞胞质内;实时定量RT-PCR结果揭示绵羊卵母细胞和早期胚胎ghrelin mRNA的相对表达量依据发育阶段的不同而呈现一定变化规律,即在成熟卵母细胞,2细胞胚胎期和8细胞胚胎期显著高于未成熟卵母细胞和4细胞胚胎期(P<0.05),囊胚期表达量最高。卵母细胞和早期胚胎中ghrelin蛋白的表达及ghrelin mRNA特定的表达模式,揭示这一新型分子在绵羊卵母细胞成熟以及胚胎早期发育过程中具有潜在的调控作用。     

制备精原干细胞滋养层细胞条件的优化

目的:优化精原干细胞培养滋养层细胞的制备条件。方法:首先根据文献资料报道和实践经验确定丝裂霉素C作用STO细胞的浓度范围和时间范围,利用双因素优选法缩短丝裂霉素C处理STO细胞的试验范围。然后采用MTT检测法确定丝裂霉素C处理STO细胞的最佳浓度和时间。结果:滋养层细胞处理后不经过冷冻保存的情况下,17.64μg/ml 2 h处理条件的STO细胞在培养14天内细胞数量基本保持稳定,其它处理条件的细胞数量均有所增加;经冷冻保存的情况下,14.72μg/ml 2 h处理条件的STO细胞在培养14天内细胞数量基本保持稳定,其它处理条件的细胞数目均有所降低。结论:滋养层细胞处理后不经过冷冻保存的情况下,17.64μg/ml 2 h的处理条件是丝裂霉素C处理STO细胞的最佳条件;经冷冻保存的情况下,14.72μg/ml 2 h的处理条件是丝裂霉素C处理STO细胞的最佳条件。     

牛精原干细胞体外分化潜能的分析

家畜精原干细胞操作的核心技术是精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的长期培养。至今家畜精原干细胞的长期培养方法还没有完善。其中的一个原因是缺乏简便有效的家畜精原干细胞生物活性鉴定手段。该研究的目的是建立一种牛精原干细胞生理潜能的体外分析方法,用于体外培养的牛精原干细胞的生物活性鉴定。首先培养牛精原干细胞,进而用干细胞因子(stem cell factor,SCF)对体外长期培养的牛精原干细胞进行诱导分化。在诱导分化过程中对细胞进行显微观察,并且用免疫荧光染色法鉴定分化的细胞。观察结果显示,经过诱导培养8 d后,牛精原干细胞形态发生了明显改变;细胞的运动行为显示出精母细胞特有的特征。免疫荧光染色结果显示,分化的细胞表达精母细胞的标记基因Scp3。上述结果例证了体外培养的牛精原干细胞具有分化为精母细胞的潜能。该研究建立了牛SSCs体外诱导分化的分析方法,用于鉴定体外培养的牛SSCs的生理潜能。但是体外诱导培养条件不能满足牛SSCs减数分裂的全部要求,导致出现一些不完全符合精母细胞特征的现象。诱导分化培养液尚需改进。     

HFSC标记在阿尔巴斯绒山羊毛囊及毛囊干细胞中的表达

旨在检测最广泛应用的毛囊干细胞标记在阿尔巴斯绒山羊毛囊组织中的表达情况,为今后内蒙古绒山羊毛囊组织学和细胞学领域相关研究提供依据。以阿尔巴斯绒山羊为研究对象,对其进行Krt15、Krt19、CD34和Sox9等的冰冻切片和细胞免疫组化实验。以上4个标记均在外根鞘中表达;Krt15、Krt19在隆突部表达,在隆突部下端不连续表达;CD34在隆突部和隆突部下端都有较强的表达;Sox9主要集中在隆突部表达。Krt15、Krt19、CD34和Sox9共同表达的部位为毛囊隆突部,因此可结合表达部位特征选用为阿尔巴斯绒山羊毛囊隆突部来源的毛囊干细胞鉴定标记。     

奶牛体细胞核移植胚胎产业化生产条件优化北大核心CSCD

通过优化高产奶牛体细胞克隆胚胎体外生产技术条件,制备高质量的奶牛克隆胚胎,旨在提高奶牛体细胞核移植产业化应用效率。就受体卵母细胞去核方法、不同年龄供体牛细胞来源、血清饥饿与否以及不同气相组成培养等条件对奶牛体细胞克隆胚胎生产效率的影响进行了研究和探讨。结果表明,虽然荧光染色辅助去核和盲吸法的去核率、囊胚发育率分别为100%、24.83%和92.44%、28.26%,两者之间无显著差异(P>0.05),但盲吸法操作简单、效率高;不同年龄来源供体牛的细胞系构建的克隆胚胎的囊胚发育率分别为31.43%、25.68%,两者之间没有显著差异(P>0.05);经血清饥饿和未饥饿供体细胞重构的克隆胚胎囊胚发育率分别为24%、29.9%,两者之间没有显著差(P>0.05);富氧和低氧气相培养的克隆胚胎的囊胚发育率分别为28.26%、31.55%,两者之间差异不显著(P>0.05),低氧气相组成更有利于囊胚的发育。根据上述结果,奶牛体细胞核移植胚胎(克隆胚胎)的产业化生产条件为:供体细胞无需进行同期饥饿处理,直接注入到盲吸去核后的受体卵子透明带下构建克隆胚胎,融合后的克隆胚胎在密封的混合三气(5%CO2-5%O2-90%N2)的气相组成下进行体外培养,能保持稳定的囊胚发育率。     

牛胎儿成纤维细胞的组织块贴附法分离培养与电穿孔法基因转染

为获得转基因克隆牛的供体细胞,采用组织块贴附培养的方法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,经2～3次传代纯化,绘制生长曲线,分别分析体外传代培养10代以内和20代以上细胞的核型特征。分别采用800、900、1000V／cm和1、5、10、15和20ms的参数组合,将线性化的带有新霉素抗性和绿色荧光蛋白双重筛选标记的人胰岛素原乳腺特异表达载体pNEI电穿孔转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,经800μg／mLG418筛选2周,继续以300μg／mLG418扩大培养2～3代,取部分筛选后的细胞进行PCR检测结果表明,体外培养的牛胎儿成纤维细胞生长旺盛,体外传代20次后核型未发生改变;转染后24～48h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光表达,筛选后各组克隆形成数以900V／cm和5ms组最多;PCR检测得到了预期条带,说明目的基因已经成功导入。分离得到的牛胎儿耳成纤维细胞有可能作为体细胞核移植的供体,进行转基因克隆研究。     

FoxA转录因子在肝脏发育中的研究进展

FoxA蛋白是一类DNA结合区具有翼状螺旋结构的转录因子,已发现其三名成员FoxAl、FoxA2和FoxA3在哺乳动物胚胎期的器官形成、成体时期的新陈代谢和内环境稳定中起着重要作用。肝脏发育FoxA亚家族成员起着关键调控作用,在肝向命运决定中扮演“先锋因子”的角色。该文对FoxA转录因子在肝脏发育中的调控作用进行了小结,综述了近年来的最新研究成果。     

利用体细胞核移植技术制作人胰岛素原转基因牛 （英文）

通过体细胞核移植技术制作了人胰岛素原转基因牛。在CMV启动子指导下以内部核糖体进入位点序列(IRES)连接的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因组成了双重标记基因的筛选系统,用于转基因细胞的富集以及细胞和植入前胚胎的筛选。转基因通过电穿孔的方法(900V/cm,5ms)转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,基因转染细胞在添加G418 (800μg/mL)的培养基中培养10天以富集转基因细胞。选择表达绿色荧光蛋白的转基因细胞作为核供体进行体细胞核移植,重构胚经体外培养至囊胚阶段,选择表达绿色荧光蛋白的囊胚进行胚胎移植。为比较基因转染以及供体细胞所处周期对转基因细胞核移植胚胎发育的影响,用作核移植供体的转基因细胞或非转基因细胞先饥饿培养2—4天(0.5 ?S) ,然后恢复培养(10?S) 10 h使细胞同步化于G1期,以正常培养的细胞作为对照进行核移植。结果表明,转基因细胞作为核供体得到的核移植胚胎的体外囊胚发育率低于以非转基因细胞为核供体的对照组(23.2% VS 35.2 %,P<0.05) ;转基因细胞周期同步化处理与否对其克隆胚囊胚发育率无显著影响(23.2% VS 18.9 %,P>0.05)。胚胎移植后2个月直肠检查发现7头受体牛(每头移植2—4枚胚胎)中有一头妊娠,并最终发育足月产下一头小牛。聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序分析表明其为转人胰岛素原基因的转基因克隆牛。     

一种快速提取质粒DNA用于鉴别重组克隆的方法

介绍了一种利用过夜培养的菌液瞬时提取质粒DNA,并用于电泳鉴别含有插入子克隆的方法。事先无需准备许多繁琐的相关试剂,提取质粒的全过程只需3~5min就可完成,非常适合于做重组克隆的快速鉴别。     

曲古抑菌素A对体外培养牛成纤维细胞组蛋白乙酰化和甲基化的影响

Trichostatin A(TSA)是一种特异的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。研究显示,TSA可以特异地抑制组蛋白去乙酰化酶活性,提高细胞的组蛋白乙酰化水平,激活基因的表达。但是,目前还不是很清楚TSA处理是否对组蛋白甲基化产生影响。本研究以成纤维细胞为研究对象,利用免疫细胞化学技术及激光共聚焦显微镜,探讨了TSA处理体细胞对其组蛋白乙酰化及甲基化修饰的影响。结果显示,随TSA浓度增加,体细胞形态发生明显的改变,细胞变得扁平且核区较大,处理后组蛋白H4K8位点的乙酰化水平随着TSA浓度的增加明显提高。检测组蛋白H3上两个甲基化位点发现,随组蛋白乙酰化水平的增加,H3K4位点的三甲基化（H3K4me3）水平也显著提高。但是,对于H3K9的二甲基化水平（H3K9me2）则没有明显变化。以上结果显示,TSA的处理不仅可以提高体细胞的组蛋白乙酰化水平,同时也增加了与基因表达激活相关组蛋白修饰位点的甲基化水平,但是对于与沉默基因相关的组蛋白修饰位点则没有明显的影响。