恶性疟原虫抗原表位的亚单位疫苗与DNA疫苗的联合免疫

构建了含有恶性疟原虫抗原基因 ( AWTE)的真核表达质粒 p CMV- AWTE,以及能在大肠杆菌中得到分泌性表达的原核表达质粒 p MC0 5 ,表达的蛋白 AWTE保持了疟原虫抗原的抗原性。将 p CMV- AWTE以及 AWTE两者混合各 1 0μg鼻腔免疫小鼠 ,一次后诱导机体产生了较高水平的体液免疫及细胞免疫     

抑癌基因PTEN转基因小鼠的构建及表型初步分析

目的:构建抑癌基因PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)的转基因小鼠模型并对其表型进行初步分析。方法:细菌人工染色体(BAC)载体系统构建打靶载体创建PTEN转基因小鼠模型;利用对鼠尾DNA进行PCR检测的方法对出生的F0代小鼠进行基因型鉴定,将阳性F_0代小鼠与野生型小鼠交配繁殖筛选稳定遗传的转基因系。分离并培养小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF),利用Western blotting检测比较转基因阳性小鼠与同窝野生型小鼠MEF细胞中PTEN的蛋白表达水平,并通过克隆形成实验对比PTEN转基因小鼠与野生型小鼠MEF细胞的增殖能力;取成年小鼠主要组织器官提取蛋白,Western blotting检测PTEN转基因小鼠主要组织的PTEN蛋白表达情况;从小鼠出生后第三周开始统计、分析并制作小鼠的体重生长曲线;此外,还对比了PTEN转基因小鼠与野生型小鼠肺、肝、脾脏的细胞大小与腹腔内的脂肪含量。结论:PTEN转基因小鼠能够存活并稳定遗传;Western blotting结果表明,不论在胚胎期还是成年期,PTEN转基因小鼠体内的PTEN蛋白水平均高于同窝的野生型小鼠,转基因小鼠的PTEN表达水平接近野生型水平的3倍;对PTEN转基因小鼠的整体表型进行初步分析,发现Pten基因在体内过表达后,小鼠的体型显著变小,而细胞大小不变;腹腔内的脂肪含量显著减少。结论:成功构建了PTEN转基因小鼠模型,并获得了生理条件下PTEN过表达的原代细胞系,为研究抑癌基因PTEN的体内生理功能提供了重要的动物模型。     

Photosan脂质立方液晶纳米光敏剂的制备及光动力杀伤效应研究

目的:制备Photosan脂质立方液晶纳米光敏剂,通过体外实验探讨其介导的光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)特异性杀伤肿瘤细胞效果。方法:以单油酸甘油酯(glyceryl monooleate,GMO)和泊洛沙姆407(poloxamer 407,P407)为液晶材料,以光敏剂Photosan为模型药物,制备Photosan立方液晶纳米粒,通过Malvern粒径仪和扫描电子显微镜等考察其理化性质;通过MTS法考察Photosan立方液晶纳米粒对正常肝细胞株和肝癌细胞株的暗毒性及光动力杀伤效果。结果:成功制备Photosan脂质立方液晶纳米粒,该纳米粒对人肝L-02细胞和人肝癌Hep G2细胞均没有暗毒性,其介导的PDT对人肝L-02细胞增殖有一定抑制作用[细胞抑制率为(32.9±1.19)%],而对肝癌Hep G2细胞增殖具有更显著的抑制作用[细胞抑制率为(77.9±2.06)%];Photosan立方液晶介导的光动力作用对人正常肝细胞的增殖抑制作用低于Photosan,但对肝癌细胞的增殖抑制作用高于Photosan。结论:Photosan脂质立方液晶纳米粒对人正常肝细胞安全性较好,对肝癌细胞的光动力杀伤效应明显优于Photosan,为光动力治疗癌症提供了创新性方法。     

GST pull-down联合质谱鉴定BAG结构域相互作用蛋白

目的:BAG结构域(BAG domain,BD)为BAG家族蛋白的基本功能结构域,通过对BAG家族蛋白6个成员的9个BDs的相互作用蛋白进行分析,以探明不同BD相互作用蛋白的异同点并为研究BAG家族蛋白多样性生物功能的分子机制提供理论依据。方法:构建p-GEX-4T2-BDs重组子并转化E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导表达GST-BDs融合蛋白并纯化。采用GST pulldown技术联合高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的策略对BDs相互作用蛋白进行定性定量分析。最后,用DAVID(The Database for Annotation,Visualization and Intergrated Discovery)和cytoscape对BDs相互作用蛋白进行GO(Gene Ontology)功能分析及KEGG(Kyoto Enyoolpedia of Genes and Genomes)通路分析。结果:在Hela细胞的胞浆蛋白中总共鉴定到370个潜在的BDs相互作用蛋白,主要为核糖体蛋白(ribosomal proteins)、翻译起始因子(Eukaryotic translation initiation factors)、翻译延长因子(Eukaryotic translation elongation factors)、泛素化-蛋白酶体相关蛋白(ubiquitin-proteasome associated proteins)及HSP40家族蛋白。GO功能富集分析结果显示,BDs相互作用蛋白涉及多种生物学功能,包括细胞内蛋白质质量控制(protein quality control)、糖代谢(glycolysis)、免疫调控(immune response)、应激反应(stress response)、细胞周期(cell cycle)等。KEGG通路分析结果表明BDs相互作用蛋白参与多条细胞内重要的信号通路,包括FGF信号通路(FGF signaling pathway)、EGF受体信号通路(EGF receptor signaling pathway)、PDGF信号通路(PDGF signaling pathway)、Ras通路(Ras pathway)等。结论:BAG家族蛋白不同成员的BD所介导的蛋白-蛋白相互作用既有共性又有特异性,BAG家族蛋白通过BDs介导多种蛋白相互作用并参与细胞内多条重要的信号通路来调控细胞内蛋白质稳态、糖代谢、免疫反应、应激反应、细胞周期等过程。     

基于Loxp-Cre系统的FBXL15基因敲除小鼠模型的建立

建立FBXL15基因条件型敲除小鼠模型,为研究该基因所发挥的重要生理功能提供材料和思路。采用KO first策略,构建打靶载体,将1st loxP插入1~2号内含子,在3~4号内含子之间插入FRT-SAIRES-lacZ-loxP-neo-loxP元件,通过Long Range PCR及Southern blot筛选出中靶克隆,随后进行囊胚注射,并将发生同源重组的ES细胞注射进C57BL/6J小鼠囊胚,移入受体小鼠子宫,最后将得到的嵌合体雄鼠与C57BL/6J雌鼠交配获得FBXL15-LoxP小鼠。PCR结果显示FBXL15的Loxp小鼠模型构建成功,该模型可为进一步研究FBXL15在胚胎发育和骨代谢中的调控作用提供工具。     

PES1慢病毒表达载体的构建及其对乳腺癌ZR75-30细胞生长的影响

目的:利用慢病毒载体表达PES1基因,研究其对乳腺癌ZR75-30细胞生长的影响.方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增PES1基因,克隆到pCDH载体,构建成pCDH-PES1,将其与包装载体共转293T细胞,包装成Lenti-PES1慢病毒载体并测定病毒滴度,感染乳腺癌ZR75-30细胞,Western印迹鉴定病毒载体...     

基于GST-pull down的小G蛋白Racl活性检测体系的建立

目的:根据人PA KI基因的p21结合结构域(PBD)能够特异结合GTP-Rac 1的特性,构建GST-PBD原核表达质粒,并利用CST-pull down方法检测真核细胞内小G蛋白RacI的活性.方法:将人PAK1基因的PBD结构域克隆到pGEX原核表达载体上,经诱导纯化得到GST-PBD融合蛋白,并通过GST-pull down实验评枯该方法的特异性和准确性.结果:pGEX-PBD质粒构建成功;纯化得到的GST-PBD融合蛋白能够特异性地与激活形式的Rac1(GTP-Rac1)结合,并且能够准确反映血小板衍生生长因子刺激下细胞内Rac1的激活过程.结论:GST-PBD融合蛋白及其整套CST-pull down检测体系能方便有效地检测细胞内Rael的活性.     

准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698在真核细胞中的表达与鉴定

目的:构建真核表达质粒pEGFP-N1-mpafp698,转染人胚肾293T细胞,并表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698.方法:PCR扩增出mpafp698序列,将其克隆入本室保存的真核表达载体pEGFP-N1中,转染293T细胞;利用RT-PCR、流式细胞仪、免疫荧光、Western 印迹检测蛋白表达.结果:构...     

DNA甲基化在动植物遗传育种中的研究进展

DNA甲基化是真核生物表观遗传学重要的机制之一,对基因转录水平的表达具有重要的调控作用。近年来,DNA甲基化在动植物遗传育种领域的研究引起了人们广泛的关注。我们从DNA甲基化与基因的表达调控、动植物基因组的甲基化状态、甲基敏感扩增片段多态性方法、DNA甲基化与杂种优势,以及DNA甲基化与分子标记等方面,简要综述了国内外有关DNA甲基化在动植物遗传育种研究中的进展,着重于全基因组DNA甲基化模式在动植物遗传育种中的相关研究和应用。