优化的Native PAGE蛋白回收方法在AFM中的应用

原子力显微镜(AFM)可以在生理条件下获得生物大分子的自然结构信息而不需要进行图像处理。虽然对含有大小范围不一的异质样品成像可以得到几纳米的分辨率,但是具有更高的亚纳米级分辨率的图像仅可以从含有单一亚基数目的高度均一的蛋白复合物获得。在重组蛋白的制备中这种蛋白复合物经常不存在,尤其是对于膜蛋白则更具有挑战性。本研究中,研究者以一种熟知的膜成孔蛋白复合物Perfringolysin O(PFO)作为模型系统,研制出一种方法来分离含有单一亚基数目的复合物,并用于随后在液相的AFM成像。具体而言,研究人员通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)分离出该复合物中特定大小的蛋白成分,然后提取时采用一种新方法使结构完整保持。预计这种方法不仅对更多其他蛋白的高分辨率AFM研究有效用,而且在基于单分子方法和生物技术应用的研究上有更普遍的用途。     

一种用于抗原-抗体相互作用研究的实验方法

蛋白抗原-抗体相互作用是生物技术领域的重要研究之一.蛋白抗原难以合成、纯化且易于降解,低质量的蛋白抗原可能会导致该研究复杂、耗时、昂贵,甚至不可靠;抗原-抗体相互作用可能涉及易接触的抗原结合位点也可能给其带来挑战.故本研究开发出高效的实验体系,仅使用相应肽段作为抗原,来研究蛋白抗原与抗体的相互作用.以抗A型肉毒杆菌抗体及其对应的抗原肽段为模型,采用原子力显微镜和凝胶电泳确定研究的最佳条件.但抗原多肽在一些常规的缓冲液中会自发聚集.在确定了阻止其聚集的条件后,通过磁性微球分选洗脱实验模拟细胞表面的抗原-抗体结合过程,验证了该研究体系的有效性.故本研究所建立的实验体系高效、简单又经济,有望为免疫学基础研究、疫苗研发和免疫治疗等医学临床与工业应用发展提供技术补充.     

鉴定人甲基化CpG结合结构域蛋白4为蛋白激酶X的底物

人蛋白激酶X(PrKX)是由X染色体编码的一种cAMP依赖性蛋白激酶,但是到目前为止已鉴定到的PrKX底物还很少.为了鉴定蛋白激酶X的底物,我们以蛋白激酶X为诱饵进行了酵母双杂交实验,结果发现甲基化CpG结合结构域蛋白4(MBD4)与PrKX在酵母细胞内相互作用较强.GST融合蛋白沉降和细胞内蛋白质的免疫共沉淀证实PrKX与MBD4之间确实存在相互作用.进一步研究表明,大肠杆菌中表达的重组MBD4在体外可以被PrKX磷酸化,而且MBD4蛋白的磷酸化能明显增强它在体外与甲基化DNA探针的结合活性.     

玉米醇溶蛋白动物体内植入后的免疫学分析方法初探

目的：为了考察玉米醇溶蛋白作为生物医用材料的应用前景,需要检测玉米醇溶蛋白植入后的免疫反应。本实验中我们将玉米醇溶蛋白管植入SD（Sprague Dawley）大鼠皮下,流式细胞仪检测植入后大鼠外周血中CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞含量的变化;对不同部位植入材料的组织学切片方法进行改进,用于后续机体免疫反应分析。方法：雄性SD大鼠八只,随机分成两组：空白对照组、材料植入组。分别于植入后一、二和四周对实验大鼠进行眼眶取血,并用流式细胞仪检测外周血中CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞的含量。皮下或肌袋植入材料四周后,将玉米醇溶蛋白管或三维多孔支架连同周围组织一起取出,用改进的石蜡切片方法制备组织切片,HE染色后观察。结果：玉米醇溶蛋白管植入后一周,蛋白管植入组CD4^＋（T—test,P〈0．01）和CD8^＋（T-test,P〈0．05）T淋巴细胞的含量下降。植入后两周和四周,蛋白管植入组CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞的含量（T—test,P〉0．05）均无明显变化。植入后一、二和四周,与空白对照组相比,蛋白管植入组CD4^＋／CD8^＋的比值（T—Test,P〉0．05）均无显著差异。改进后的切片方法可以制备出完整的、并且耐HE（hematoxylin—eosin）和免疫组化染色处理的组织学切片。结论：利用流式细胞仪检测出了大鼠皮下植入玉米蛋白管后外周血中CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞的含量变化。并且,克服了切片制备过程中材料的脆性问题和贴片不牢固问题,可以进行HE和免疫组化染色处理,为进一步深入地分析玉米醇溶蛋白植入机体后的免疫反应打下了基础。     

纳米粒子表面修饰对其与细胞膜相互作用的影响

纳米粒子在生物医学上的应用越来越广泛,其进入细胞的机制与规律是设计与开发的基础．已有研究发现,表面修饰不同亲疏水性基团的金纳米粒子,在内吞机制被抑制时,进入细胞的能力明显不同．更特别的是,粒子表面亲水性基团与疏水性基团呈间隔条纹规则排列的纳米粒子,与其他修饰成分相同仅排列不同的纳米粒子进入细胞的规律区别显著．这一特殊现象无法用已有的纳米粒子进入细胞的机制解释．本文针对该研究结果,将纳米粒子与细胞的体系简化,定量分析了3种不同纳米粒子进入细胞前后的不同状态,计算获得了表面修饰不同亲疏水性基团的纳米粒子与细胞膜之间相互作用的Flory．Huggins自由能．结果发现,修饰规则间隔排列亲疏水基团的纳米粒子,其作用自由能在与细胞接触前后变化最大．研究结果不仅解释了实验发现,同时预示了纳米粒子进入细胞的新机制．     

髋关节假体脱位分析软件的设计与开发

目的研发了髋关节假体脱位分析软件。软件基于ADAMS/VIEW软件进行二次开发,能够可视化的构建三维参数化的髋关节假体模型,模型能够模拟假体的六种运动。应用此软件可以为病人更好的选择和植入假体,评估各种髋关节假体的安全活动范围,用来设计新的关节假体。     

“中国力学虚拟人”研究及应用

该课题利用"中国可视化人"项目研究成果和志愿者的相关数据,建立了人体全身和部分细分部位的骨肌系统生物力学仿真模型。模型可以按真实对象进行改造,并可植入人工关节等植入物。在所建实验平台中,通过运动捕捉系统测得的或人为设计的运动数据,模型可以仿真人体各种行为运动,进行动力学分析,计算关节力、关节力矩和肌肉力。成果集成在所开发的软件CMVHuman1.0中,完成软件注册登记,并建立了产业化服务体系。成果已在临床医学和植入物设计中获得广泛应用,并扩大到体育科学、人体工程学、航空、航天和虚拟士兵等领域。     

细菌蛋白质乙酰化研究进展

在真核生物和原核生物中,蛋白质乙酰化行使重要的功能。过去几十年,在细菌中发现了大量的新的乙酰化蛋白。聚焦于蛋白质Nε的乙酰化。首先介绍蛋白质乙酰化的发现和发展史,其次概述了ACS、CheY等乙酰化后的功能,乙酰化和泛素化、磷酸化之间的关系。在技术层面,讨论了蛋白质芯片用于发现新的乙酰化酶、去乙酰化酶以及新的乙酰化蛋白的优势和可能性;详细讨论了免疫沉淀富集结合高分辨率质谱和生物信息学分析来高通量发现乙酰化蛋白的有效性,并且提出了改进措施。最后,展望了细菌乙酰化有待研究的关键问题以及与其他酰化之间的关系。     

单细胞转录组技术及其在人类细胞图谱构建中的应用

单细胞转录组技术在单细胞水平上进行转录组测序,提供了单个细胞的基因表达差异信息,使在单细胞尺度下研究个体细胞、相关环境细胞及其相互作用的机理成为可能.近年来,单细胞转录组技术在c DNA扩增原理上经历了从末端加尾、体外逆转录到模板置换的方法发展,大大提高了基因检测的数量、基因表达的准确性等.同时,在单细胞选取方式上进行了从96/384孔板到油包水液滴以及纳米微孔的创新,在提高通量和重复性的同时降低了整体实验成本.单细胞转录组技术广泛应用于细胞群体分类和异质性研究,推动了从发育生物学到正常、病态组织细胞图谱的构建.本文对单细胞转录组技术近年的技术进展以及在人类细胞图谱构建中的应用进行了综述.