淡水鱼类寄生粘孢子虫两新种的记述

在整理1982年从湖北省宜都市和1984年从湖北省黄岗市团风镇采集的长江鱼类粘孢子虫标本的过程中,作者发现寄生于鳜Siniperca chuats(Basilewsky)和蛇(Saurogobio dabrui Bleeker)的两种粘孢子虫,经鉴定是文献中没有报道的新物种1。模式标本保存在中国科学院水生生物研究所鱼病病原标本室。       

红笛鲷仔鱼体内特异性母源抗体降解动力学研究

应用山羊IgG免疫红笛鲷亲鱼,人工催产孵化出仔鱼后,用双抗体夹心法检测仔鱼特异性抗体的降解过程,发现抗体水平随时间变化呈下降趋势且可以持续7d,每尾仔鱼特异性抗体降解量约0.001μg,最低检测限为0.482μg/mL。采用饱和硫酸铵分步盐析与亲和层析等方法纯化红笛鲷仔鱼特异性抗体,结果显示,盐析仔鱼特异性抗体最理想的硫酸铵饱和度为40%－50%;亲和层析分离到两个明显独立的层析峰。SDS-PAGE证明纯化的抗体具有极高纯度,其L、H链分子量分别为29 kD和77.5 kD,抗体分子量约为852 kD。该抗体不仅能够与山羊IgG产生特异性免疫反应,而且能与兔抗红笛鲷IgM抗血清产生免疫反应,因而认为红笛鲷母源抗体可以垂直转移至仔鱼。     

无乳链球菌诱导吉富罗非鱼分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的克隆及原核表达

以灭活的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)诱导后的吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆到吉富罗非鱼(O.niloticus)分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。sIgM基因cDNA全长为1 921 bp,开放阅读框(ORF)为1 740 bp,5'端非编码区(5'-UTR)41 bp,3'端非编码区(3'-UTR)140 bp,编码579个氨基酸,N端有信号肽结构。预测分子量(MW)为64.26 kD,理论等电点(pI)为5.36。系统进化树分析显示,吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和军曹鱼(Rachycentron canadum)的亲缘关系较近。sIgM基因有4个恒定区。将吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM基因恒定区序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28-sIgM,诱导表达后确定最优条件为37℃条件下,IPTG浓度为0.05 mmol/L时诱导4 h蛋白表达量最大。纯化蛋白后经Western blot分析,sIgM融合蛋白与鼠抗His-Tag发生特异结合,表明目的蛋白成功表达。     

尼罗罗非鱼NCCRP-1基因的原核表达及条件优化

非特异性细胞毒性细胞受体蛋白(non-specific cytotoxic cell receptor protein 1,NCCRP-1)是一种在鱼类非特异性细胞毒性细胞(non-specific cytotoxic cell,NCC)活化过程起到关键作用的受体蛋白,也是NCC表面的一种分子标记。本研究根据NCBI上已公布的罗非鱼NCCRP-1基因序列,设计一对带酶切位点的引物,经PCR扩增、酶切、连接等步骤,构建罗非鱼NCCRP-1基因的原核表达质粒p GEX-NCCRP-1,将重组质粒导入至大肠杆菌BL21中,成功表达了NCCRP-1重组蛋白。对影响NCCRP-1表达的IPTG浓度、诱导时间、诱导温度等因素进行了优化,发现在20℃下,采用0.2 mmo I/L IPTG诱导5 h,可以诱导NCCRP-1可溶性重组蛋白的高效表达。而免疫印迹结果显示,经纯化后的重组蛋白可与GST-Tag单克隆抗体发生特异性反应,进而表明表达的重组蛋白是罗非鱼NCCRP-1蛋白。该结果为后续罗非鱼NCCRP-1的单克隆抗体制备以及NCCRP-1相关的功能研究奠定了重要基础。     

溶藻弧菌kdpD基因敲除突变株的构建及其表型特征

【目的】探究kdpD基因对溶藻弧菌生物学特性的影响。【方法】采用Overlap PCR和同源重组技术,结合正负向筛选,构建kdpD基因无标记基因框内敲除突变株,比较kdpD突变株和野生株HY9901在生长速率、胞外蛋白酶活性以及毒力等方面的差异。【结果】成功构建溶藻弧菌kdpD基因敲除突变株。体外实验表明,kdpD的缺失对溶藻弧菌的生长曲线和胞外蛋白酶活性的影响不明显,但是突变株的泳动能力和生物被膜形成能力出现下降。斑马鱼致病性试验结果显示,突变株毒力下降了8.84倍。【结论】kdpD基因参与调控溶藻弧菌的泳动能力、被膜形成和毒力,但不影响生长速率和胞外蛋白酶活性。     

我国淡水鱼类粘孢子虫的支序分类学研究

本研究选取15个主要特征对我国淡水鱼类23属粘孢子虫的支序分类进行了分析.结果表明,根据这15个特征构建的经典分支系统树与现有分类系统较为一致;而许多被分子系统学证明有争议的特征,如尾孢虫的尾突,孢子和极囊的形状等在研究粘孢子虫的系谱发育中仍然有着重要作用,剔除了上述特征的分支系统树与经典的分支系统树相比,存在许多缺陷.嗜碘泡是区分粘体虫和碘泡虫的主要特征,然而剔除嗜碘泡特征的分支系统树与经典的分支系统树区别不大,因此,我们建议在这一方面和国际学术界统一起来,即不再把嗜碘泡作为区分碘泡虫和粘体虫的主要特征.     

溶藻弧菌HY9901 AcrA基因克隆与序列分析

Touchdown PCR扩增溶藻弧菌HY9901 AcrA基因部分序列,得一460bp片段,再以反向PCR和巢式PCR联合扩增其侧翼序列,拼接得一由1101 nt组成,共编码366 aa的完整基因.该基因演绎的氨基酸序列与几种弧菌的同源性都比较高,与创伤弧菌YJ016、副溶血弧菌RIMD 2210633、灿烂弧菌12B01、霍乱弧菌O1 N16961同源性分别为76%、73%、71%和70%.     

溶藻弧菌HY9901 ahr基因克隆与序列分析

TouchdownPCR扩增溶藻弧菌依赖ATP的DNA解旋酶rep基因部分序列,得一1．2kb片段,再以反向PCR和巢式PCR联合扩增其侧翼序列,拼接得一由2016bp组成,共编码671aa的完整基因。该基因演绎的氨基酸序列与几种弧菌的同源性都比较高,与副溶血弧菌RIMD2210633、溶藻弧菌12G01、Vibriosp．Ex25、创伤弧菌YJ016、霍乱弧菌RC385、灿烂弧菌12801、费氏弧菌ES114及矿angustumS14分别为96％、95%、95%、94%、92％、91%、89％、86％。     

南极衣藻谷胱甘肽-S-转移酶基因的表达及其对大肠杆菌低温耐受性的增强作用

谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase, GST, EC2.5.1.18)是生物体内一种重要的抗氧化酶, 为阐明GST在南极衣藻(Chlamydomonas sp. ICE-L)中的具体地位, 采用实时荧光定量PCR对不同温度下南极衣藻的GST基因的表达进行了分析; 并构建了原核表达载体pET28a(+)-GST, 转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达, 通过平板培养法探讨了重组菌E. coli BL21(pET28a(+)-GST)对低温胁迫的耐受性。结果显示, GST在0℃时表达量最高, 最高可达对照组的两倍多; pET28a(+)-GST重组表达载体在E. coli BL21中实现了高效表达, 且主要以包涵体形式存在, 经HisTrap HP柱分离纯化获得高纯度的GST融合蛋白, 并通过SDS-PAGE及Western blot分析得以验证; 对低温胁迫实验发现南极衣藻GST蛋白的表达可以提高重组菌E. coli BL21对低温的耐受性, 说明GST基因对南极衣藻适应南极低温环境具有重要作用。