高原鼠兔肝中Ldh-c基因的表达及其对无氧糖酵解水平的影响

高原鼠兔(Ochotona curzoniac)对高原低氧环境有很强的适应性。我们研究发现,精子特异性乳酸脱氢酶(LDH-C4)在高原鼠兔肝组织中表达。为了阐明LDH-C4对高原鼠兔肝组织无氧糖酵解水平的影响,将20只高原鼠兔随机分为抑制剂组和空白对照组,每组10只。抑制剂组注射1 mol/L LDH-C4特异性抑制剂N-异丙基草氨酸盐(N-isopropyl oxamate)于高原鼠兔股二头肌,双侧各注射500μl,空白对照组注射等剂量的0.9%生理盐水。应用荧光定量PCR和western blot方法,测定了精子特异性乳酸脱氢酶基因(Ldh-c)在高原鼠兔肝组织中的表达水平,应用高压液相色谱法测定了血液中抑制剂的浓度,用生物化学方法测定了抑制剂组和空白对照组高原鼠兔肝组织中乳酸脱氢酶(LDH)比活力以及乳酸(LD)和ATP含量。结果表明,在m RNA和蛋白水平,Ldh-c基因在高原鼠兔肝组织中均有表达,m RNA相对表达水平为0.22±0.04,蛋白相对表达水平为0.97±0.20;当肌肉注射1 mol/L的抑制剂30 min后,血液中抑制剂浓度为0.08 mmol/L,肝组织中乳酸脱氢酶比活力抑制剂组和空白对照组分别为(4 990±290)U/g和(7 360±420)U/g,抑制剂组和空白对照组乳酸含量分别为(0.38±0.05)mmol/g和(0.53±0.03)mmol/g,抑制剂组和空白对照组ATP含量分别为(5.84±0.83)μmol/g和(7.78±1.06)μmol/g,经单因素方差分析,抑制剂组的乳酸脱氢酶比活力和乳酸及ATP含量均显著下降(P0.01);抑制剂对乳酸脱氢酶比活力和乳酸及ATP含量的抑制率分别为30.19%±3.90%、32.22%±8.70%和24.94%±7.80%。以上结果说明,Ldh-c在高原鼠兔肝组织中表达,LDH-C4通过催化无氧糖酵解过程,为其肝组织生命活动提供至少24%的ATP,这可能使高原鼠兔减小了在低氧环境中对氧气的依赖,增强了对低氧环境的适应力。     

高原鼢鼠肝脏组织细胞周期相关基因的进化和表达

高原鼢鼠Myospalax baileyi是一种世居青藏高原的地下鼠,对严重的低氧环境有很强的适应性。低氧诱导细胞周期G1、G2期阻滞。为了探讨高原鼢鼠适应低氧环境的分子机制,应用生物信息学方法对p53下游细胞周期基因p21、CyclinD1、CyclinE、CDK6、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α、B99和CyclinB1的序列和编码的氨基酸序列进行了进化分析,并以SD大鼠Rattus norvegicus为对照,研究了这些基因在不同海拔(3300 m、2260 m)条件下的表达模式。结果表明:(1)高原鼢鼠细胞周期相关基因的序列与以色列鼹鼠Nannospalax galili同源性最高,达到90%以上;p21、CyclinD1、CyclinE和CyclinB1编码蛋白与以色列鼹鼠存在明显的趋同进化位点;SIFT评估发现,p21和CyclinB1氨基酸序列分别在第27号位点和第105号位点的变异对细胞周期调控功能有显著影响;(2)与低海拔条件相比,在高海拔条件下,高原鼢鼠肝脏组织中与G1期相关的基因p21表达水平显著上升,p21下游基因CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2表达水平显著下降,而在SD大鼠中没有显著变化;与G2期相关的基因Gadd45α、B99、14-3-3-δ和CyclinB1在高原鼢鼠和SD大鼠中随海拔变化不发生明显变化。在不同海拔条件下,高原鼢鼠肝脏组织中的上述细胞周期相关基因的表达水平均极显著高于SD大鼠(P<0.01)。以上结果提示,高原鼢鼠经过长期的低氧适应,通过上调p21基因的表达抑制下游CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2基因的表达,导致细胞周期G1期阻滞,从而提供充足的时间进行DNA修复,保证了DNA复制的准确性;同时高原鼢鼠肝脏组织中细胞周期的调控不仅与细胞周期基因的表达水平有关,而且可能与细胞周期因子p21的第27号位点和CyclinB1的第105号位点的变异有关。     

高原鼢鼠对低氧高二氧化碳环境适应的相关血液生理指标的季节变化

高原鼢鼠是终生生活于地下封闭洞道中的一种啮齿动物。为了探讨高原鼢鼠对低氧和高二氧化碳环境的适应机制,对春、夏和秋三季高原鼢鼠血液生理指标以及心肌和骨骼肌肌红蛋白含量进行了测定。春、夏和秋季高原鼢鼠动脉血和静脉血pH值分别为7.44±0.09、7.44±0.05、7.51±0.07和7.17±0.05、7.29±0.07、7.35±0.08,动脉血pH在不同季节没有显著性差异,静脉血pH春季显著低于夏季和秋季。动脉和静脉血二氧化碳分压(Pco2)分别为47.81±14.50mmHg、55.10±13.50mmHg、53.00±10.81mmHg和75.17±31.09mmHg、75.40±20.21mmHg、80.00±17.44mmHg,没有季节性差异;动脉和静脉血氧分压(Po2)分别为76.17±33.24mmHg、78.90±16.61mmHg、88.67±24.94mmHg和7.34±4.07mmHg、10.60±2.76mmHg、10.33±3.56mmHg,没有季节性差异;动脉和静脉血血氧饱和度(SaO2)分别为92.71%±5.00%、94.70%±3.65%、96.00%±4.38%和4.27%±3.03%、9.01%±5.26%、9.67%±6.02%,动脉血SaO2没有季节性差异,而静脉血SaO2春季显著低于夏季和秋季。血液红细胞数(RBC)、血红蛋白(Hb)和红细胞压积(HCT),从春季到冬季依次增加,并具有显著性差异,血清诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)活力随着夏季洞道中二氧化碳浓度的增加而显著提高。心肌和骨骼肌肌红蛋白(Mb)含量春季显著高于夏季和秋季,红细胞内2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)含量秋季显著高于春季和夏季。上述结果表明:随着洞道中氧气和二氧化碳浓度的季节波动,高原鼢鼠通过调节氧转运有关的功能蛋白含量以及氧代谢有关的生理机制维持组织的氧平衡。     

高原鼢鼠和高原鼠兔骨骼肌糖酵解和肝脏乳酸代谢的差异(英文)北大核心CSCD

高原鼠兔(Ochotona curzoniac)和高原鼢鼠(Myospalax baileyi)是青藏高原地区特有的土著动物。本文旨在探讨高原鼠兔和高原鼢鼠骨骼肌糖酵解和肝脏乳酸代谢的不同生理机制。我们克隆出两种动物肝脏中的丙酮酸羧化酶(pytuvate carboxy-lase,PC)基因的部分序列;应用real-timePCR法测定两种动物肝脏和骨骼肌中PC、LDH-A和LDH-BmRNA的表达水平;使用苹果酸偶联法测定肝脏中PC酶活力,并测定两种动物骨骼肌和肝脏中乳酸含量、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活力;用聚丙烯酰胺凝胶电泳观察肝脏和骨骼肌LDH同工酶谱。结果显示:(1)高原鼢鼠骨骼肌LDH-BmRNA的表达量极显著高于高原鼠兔(P<0.01),而LDH-AmRNA的表达量没有差异(P>0.05);(2)高原鼠兔肝脏中PC、LDH-A和LDH-BmRNA的表达量都极显著高于高原鼢鼠(P<0.01);(3)高原鼠兔肝脏和骨骼肌中LDH和乳酸含量以及肝脏中PC活力均极显著高于高原鼢鼠(P<0.01);(4)LDH同工酶谱显示,高原鼠兔骨骼肌以LDH-A4、LDH-A3B、LDH-A2B2为主,而高原鼢鼠骨骼肌以LDH-AB3、LDH-B4为主;在高原鼠兔肝脏中LDH以LDH-A3B,LDH-A2B2,LDH-AB3和LDH-B4为主,而高原鼢鼠肝脏只有LDH-A4。以上结果表明,高原鼠兔通过提高骨骼肌无氧糖酵解的水平为其快速奔跑提供能量,通过提高肝脏中糖异生水平快速将骨骼肌运动所产生的乳酸转化为葡萄糖和糖原,所以减少了在低氧环境中对氧的依赖,而高原鼢鼠尽管生活在低氧的地下洞道,它通过提高骨骼肌有氧糖酵解的水平,为其持续的挖掘活动提供能量。     

高原鼢鼠肺组织细胞凋亡相关 基因的进化分析及其在不同 海拔条件下的表达模式

高原鼢鼠（Myospalax baileyi）是青藏高原特有的地下鼠,其地下洞道严重缺氧。一般来说,低氧会促进细胞凋亡。为了探讨高原鼢鼠适应低氧环境的分子机制,本文应用生物信息学方法对p53下游凋亡促进基因Pidd、Fas、Bax、Puma、Apaf-1、Scotin、Perp、Igfbp3和凋亡抑制基因Bcl-2的序列和编码的氨基酸序列进行了进化分析,并以SD大鼠（Rattus norvegicus）为对照,研究了这些基因在不同海拔环境条件下（3 300 m和2 260 m）的表达模式。结果表明：（1）高原鼢鼠细胞凋亡基因的序列与以色列鼹鼠（Nannospalax galili）同源性最高;预测的PIDD、PUMA、Apaf-1、IGFBP3和BCL-2编码蛋白结构域与以色列鼹鼠的存在明显的趋同进化位点;SIFT评估发现,高原鼢鼠和以色列鼹鼠与其他物种相比,p53、PIDD、PUMA、Apaf-1和IGFBP3氨基酸序列分别在78、853、157、320和285号位点的变异对其功能有显著影响;（2）在高海拔条件下（3 300 m）,高原鼢鼠肺组织中凋亡促进基因Pidd、Bax、Puma和Apaf-1表达水平显著下降,凋亡抑制基因Bcl-2表达水平显著升高,而在SD大鼠中凋亡促进基因和凋亡抑制基因的表达水平均没有变化;高原鼢鼠中Bcl-2/Bax比值随海拔的升高显著上升,而在SD大鼠中没有变化。以上结果提示,高原鼢鼠p53结构变异可能导致其下游基因表达模式与SD大鼠不同,其中凋亡促进基因Pidd、Bax、Puma和Apaf-1表达水平下降,凋亡抑制基因Bcl-2表达水平上升,从而抑制了细胞在低氧条件下的凋亡;在长期低氧的作用下,高原鼢鼠p53下游基因产物PIDD、PUMA、Apaf-1和IGFBP3产生了影响其功能的变异位点,这可能改变了它们与发挥功能的复合物的结合力,从而抑制了细胞凋亡。因此,通过长期的低氧适应,高原鼢鼠肺组织中与细胞凋亡相关的基因产物结构发生变异,导致其基因表达水平发生变化,从而抑制细胞凋亡,这是高原鼢鼠适应地下低氧洞道生境的分子机制之一。     

环磷酰胺对长爪沙鼠精子畸形的影响

目的探讨环磷酰胺（CP）对长爪沙鼠精子畸形的影响。方法取长爪沙鼠随机分成正常对照组,CP组（低、中、高剂量组即剂量分别为20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg）,环磷酰胺经腹腔注射,连续注射5 d,药后30d麻醉沙鼠,剖腹取出两侧附睾制备精子悬液涂片,用甲醇固定10 min,用2%的伊红染色30 min,蒸馏水洗片,显微镜观察精子形态。结果低、中、高剂量组分别与正常对照组比较,长爪沙鼠精子畸形率差异极显著（P〈0.01）;低、中剂量组分别与高剂量组相比较,长爪沙鼠精子畸形率差异极显著（P〈0.01）;低剂量组与中剂量组比较,精子畸形率差异不显著（P〉0.05）。形态学观察显示：环磷酰胺对长爪沙鼠精子影响畸形类型主要为尾折叠、尾粗细/长短/扭曲和无钩。结论环磷酰胺对长爪沙鼠精子有一定的致畸率,且对长爪沙鼠精子尾部影响最大。在一定剂量内范围内,环磷酰胺对长爪沙鼠的精子致畸率无明显区别;当高于一定剂量,随着环磷酰胺用药剂量的增加,长爪沙鼠的精子致畸率也增加。     

腹腔注射腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对高原鼠兔骨骼肌Ldhc基因的沉默效果

腹腔注射是一种简单且方便给药的方式,为了验证腹腔注射腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对高原鼠兔(Ochotonacurzoniac)骨骼肌Ldhc基因沉默的可行性,将27只高原鼠兔分为干扰组、空壳组和空白对照组,每组各9只个体,干扰组和空壳组分别注射0.65ml腺病毒pMultiRNAi-Ldhc和腺病毒pMultiRNAi-NS,空白对照组注射等量生理盐水,注射后7d检测骨骼肌中Ldhc基因mRNA和蛋白的表达水平,测定了乳酸脱氢酶(LDH)活性和乳酸(LD)及三磷酸腺苷(ATP)的含量。结果表明,与空白对照组相比,干扰组在mRNA和蛋白水平上,Ldhc基因表达分别降低了41.73%和15.76%;乳酸脱氢酶(LDH)活性、乳酸(LD)和ATP含量分别降低了23.98%、51.08%和19.29%。结果说明,腹腔注射腺病毒pMultiRNAi-Ldhc能有效沉默骨骼肌中Ldhc基因表达。     

高原鼢鼠、鼠兔及大鼠心肌和骨骼肌乳酸脱氢酶活力及同工酶谱

为了探讨高原鼢鼠和鼠兔的低氧适应机理,用紫外分光光度法测定了高原鼢鼠、鼠兔及大鼠心肌和骨骼肌乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)的活力,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离了LDH同工酶.结果显示:鼢鼠、鼠兔、大鼠心肌LDH活力分别为16.90±2.00 U/mg pro,20.55±2.46 U/mg pro,38.26±6.78 U/mg pm,鼢鼠和鼠兔差异不显著(P>0.05),大鼠与鼠兔差异显著(P<0.05),大鼠与鼢鼠差异极显著(P<0.01);骨骼肌LDH活力,鼢鼠、鼠兔、大鼠分别为39.34±3.74 U/mg pro,78.33±9.54 U/mg pro,67.80±10.89 u/mg pr0,大鼠和鼠兔差异不显著(P>0.05),二者均极显著高于鼢鼠(P<0.01).高原鼠兔与鼢鼠LDH同工酶M亚基的迁移率较为相近,而H亚基差别较大;鼢鼠和大鼠H亚基的迁移率较为相近,而M亚基差别较大.鼢鼠和鼠兔心肌LDH同工酶亚基组成以H亚基为主,M亚基含量较低,而骨骼肌LDH同工酶亚基组成以M业基为主,H业基含量较低.大鼠心肌和骨骼肌LDH同工酶H亚基和M亚基含量均很丰富.说明高原鼢鼠和鼠兔虽然生活在极其缺氧的环境中,但它们的组织并不缺氧;高原鼢鼠和鼠兔以不同的策略适应高原缺氧.     

高原鼢鼠、高原鼠兔和大鼠肺表面活性物质组成和含量的比较

本研究通过分析肺表面活性物质(pulmonary surfactant,PS)组成和含量探讨高原鼢鼠(Myospalax baileyi)和高原鼠兔(Ochotona curzoniae)的低氧适应机制。高原鼢鼠和高原鼠兔各36只,捕捉于海拔3600 m左右的青海省海南州贵德县拉脊山地区,36只Sprague-Dawley(SD)大鼠购自海拔1500 m左右的兰州大学实验动物中心。所有动物麻醉后通过肺循环进行肺灌洗,充分洗净肺组织中的血液,取出完整的肺组织灌洗得到肺泡灌洗液。应用高效液相色谱法分析三种动物PS中磷脂的组成和含量;应用G-250考马斯亮蓝法、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和质谱测序分析PS蛋白质的含量和种类;应用溶氧电极测定了PS溶液中的溶氧量。结果表明:高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠PS中,总磷脂含量依次显著增加(P<0.05),总蛋白含量依次显著减少(P<0.05);三种动物PS中均含有亚油酰棕榈酰胆碱(linoleic palmitoylphosphatidylcholine,LPPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine,DPPC)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)和磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PSe)等5种磷脂成分,但其相对含量明显不同;在高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠中,LPPC所占比例依次显著增加(P<0.01);高原鼢鼠PS磷脂中,DPPC、PG和PI所占比例极显著高于高原鼠兔(P<0.01),高原鼠兔与SD大鼠之间没有显著差异(P>0.05);高原鼢鼠与高原鼠兔PS磷脂中,PSe所占比例没有显著差异(P>0.05),但均极显著高于SD大鼠(P<0.01)。三种动物PS中均含有血清白蛋白(serum albumin,SA),高原鼢鼠和高原鼠兔PS中含有血红蛋白β亚基构成的含血红素的同源四聚体蛋白,高原鼢鼠和SD大鼠PS中含有免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)重链残基,高原鼢鼠Ig重链残基含量极显著高于SD大鼠(P<0.01),含血红素蛋白含量显著高于高原鼠兔(P<0.05)。高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠PS溶液中溶氧量依次显著减小(P<0.01),但均显著高于生理盐水(P<0.01)。以上结果提示,高原鼢鼠和高原鼠兔PS中总蛋白含量显著增加,总磷脂含量显著减少,蛋白成分中含有高含量的含血红素同源四聚体蛋白,且高原鼢鼠主要磷脂成分DPPC的相对含量显著增加,这种PS成分和含量的变化增强了这两种高原动物对低氧环境的适应性。     

高原鼢鼠和高原鼠兔肺细叶的结构特征

高原鼢鼠和高原鼠兔是青藏高原土著动物,对低氧具有很好的适应性.为了探讨在低氧环境中两者肺细叶结构的适应特征,应用体视学方法测量了肺细叶相关指标.结果发现 :高原鼢鼠和高原鼠兔肺单位面积肺泡数显著高于SD大鼠,单个肺泡面积和弹性纤维/肺实质比显著低于SD大鼠;高原鼢鼠肺泡隔厚度最厚,高原鼠兔最薄,且三种动物具显著差异; 高原鼢鼠和高原鼠兔气-血屏障的算术平均厚度(Ta)和调和平均厚度(Th) 均显著低于SD 大鼠;在三个级别的微血管中,高原鼠兔中膜肌层厚度显著低于高原鼢鼠,两种高原动物均显著低于SD大鼠;高原鼢鼠和高原鼠兔的微血管密度(MVD)显著高于SD大鼠.以上结果表明,高原鼢鼠和高原鼠兔肺细叶结构特征表现出一定趋同,这些特征有利于在低氧条件下提高肺气体扩散容量;但是,肺泡隔厚度和微血管中膜肌层厚度/血管外径比又表现出明显的差异,可能是不同生境造成的[动物学报 54(3):531-539,2008].