酵母基因中断技术

酵母基因中断技术是研究酵母基因功能的重要手段,自80年代初诞生以来经历了不断的改进和发展.PCR介导的酵母基因中断技术,大大简化了操作,实现了酵母基因的精确缺失;酵母基因的多重中断技术,可在酵母内实现多个基因的中断;可进行大规模基因中断和功能分析的酵母基因中断技术,适应了在酵母全基因组测序完成的情况下进行功能基因组学研究的要求.酵母基因中断技术对人类基因功能研究也有很大启示作用.     

RIOK3促进了caspase-10对PAK2的酶解激活

RIO3为非典型激酶RIO家族的成员之一,仅在多细胞真核生物中出现,为研究RIOK3蛋白的功能,以其作为诱饵蛋白对成人肝cDNA文库进行酵母双杂交筛选,得到其相互作用蛋白PAK2,并通过细胞内免疫共沉淀和免疫荧光共定位实验验证了该相互作用。实时定量PCR和免疫印迹检测结果显示,RIOK3能够在蛋白水平上降低PAK2表达量。通过CCK-8和细胞凋亡检测,发现二者共表达可以抑制增殖并促进凋亡,并且这一促凋亡效应可以被caspase-10的无酶活最短剪切本caspase-10G所抑制。实验结果显示,RIOK3可能促进了caspase-10对PAK2的酶解,在PAK2的酶解激活途径中发挥重要作用。     

绿色荧光蛋白GFP基因与新生隐球菌荚膜基因的融合表达系统

目的构建新生隐球菌荚膜基因与绿色荧光蛋白的融合表达系统。方法PCR法扩增CAP60基因片段,测序验证其准确性。将其与多个必需基因共同连人穿梭质粒。结果获得6150bps大小的质粒,该质粒含有荚膜基因启动子、终止子及荧光蛋白的基因。结论将新生隐球菌荚膜基因与荧光蛋白基因融合表达,将会有利于对荚膜的生化合成途径作进一步研究。     

人SSX2IP与14-3-3η蛋白相互作用研究

人类SSX2IP是SSX2蛋白的相互作用蛋白,它与肿瘤的发生、发展有着密切的相关性。为进一步阐明人类SSX2IP蛋白的潜在功能,以其作为诱饵蛋白对成人肝cDNA文库进行酵母双杂交筛选,结果筛到了SSX2IP的一个新相互作用蛋白14-3-3η。利用GSTPull-down实验和细胞内免疫共沉淀实验在体内外验证了该相互作用的真实性。通过免疫荧光共定位实验发现SSX2IP和14-3-3η共表达于HeLa细胞时,它们共定位于胞质及核周。利用CCK-8法检测SSX2IP和14-3-3η对HEK293T细胞增殖的影响,发现共转染SSX2IP和14-3-3η后,HEK293T细胞的增殖速度有所提高。这些结果为进一步深入研究SSX2IP与14-3-3η的相互作用及其生物学功能提供新的线索。     

MIP与NFκB关键调节因子NEMO相互作用的初步研究

人类基因MIP是一个2000年克隆得到的抑癌基因。已有研究表明它可以与FASP1、MafF等多个蛋白相互作用,具有参与信号传导、调节基因转录等功能。有关MIP抑制某些肿瘤细胞生长的确切机制目前还不明确。本研究首先以MIP为诱饵基因对人胎盘cDNA文库进行了酵母双杂交筛选,发现了一个新的MIP相互作用蛋白片段——NFκB关键调节因子NEMO（NFκB essential modifier）蛋白的部分片段,     

乳酸克鲁维酵母高拷贝整合载体的构建及应用

用酿酒酵母２６ｓ ｒＤＮＡ作探针克隆乳酸克鲁维酵母Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ２．２ｋｂ ｒＤＮＡ片段,对其作限制内切酶图谱分析。以该基因片段为同源整合的靶顺序,酿酒酵 ＵＲＡ３基因为选择标记构载体质粒ｐＩＲＫ并对其在宿主Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＷ９８－８ｃ细胞中的整合位点,拷数及稳定性进行测定和分析。     

酵母双杂交系统在膜蛋白相互作用研究中的应用

膜相关蛋白约占细胞总蛋白质中的1/3,它们大都参与了细胞的诸多生理、病理过程和药物反应机理。研究膜蛋白的相互作用对于揭示细胞的生命活动规律及寻找药物作用靶标都有重要的意义。由于膜蛋白本身的特性及其难以进入核内等原因,经典的酵母双杂交技术并不适用于检测膜蛋白间的相互作用。针对在活细胞中研究膜蛋白相互作用的需要,近年来国际上先后发展了一系列用于膜蛋白相互作用研究的酵母双杂交新系统,并取得了许多重要发现。     

基于叶绿体基因rbcL和psbA-trnH间区探讨石杉科植物系统关系

关于石杉科Huperziaceae植物的分类,一直存在一些争议。在旧的分类体系中石杉科植物被包含在一个混合的石松科Lycopodiaceae和多谱系的石松属Lycopodium中。本文利用叶绿体rbcL基因和psbA-trnH基因间区序列探讨石杉科植物的系统位置及石杉科内部的分类关系,用最大简约法和邻接法对自测序列结合由GenBank下载的rbcL及psbA-trnH基因间区序列进行系统发育分析。结果显示,石杉科与Phylloglossum属关系较近,与石松科关系较疏远。在石杉科中热带石杉属Huperzia植物和马尾杉属Phlegmariurus植物的关系要比它们与其他石杉属植物更近。所以,我们的rbcL基因数据不支持秦仁昌关于石杉科分为石杉属和马尾杉属的分类处理。但是,因为我们的psbA-trnH序列没有包括热带种类,对石杉属植物和马尾杉属植物的关系无验证。因此需要更多的样品和序列数据进一步探讨石杉科的演化关系。     

烟曲霉Asp f3和Asp f4线性B细胞抗原表位最小基序鉴定

烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是一种广泛存在于自然界中的条件致病菌,其产生的分生孢子被易感人群吸入后定植于肺部,引起3种曲霉病:致咯血的曲霉肿、致肺纤维化的变应性支气管肺曲霉病、致较高死亡率的侵袭性曲霉病。目前临床上用于诊断烟曲霉感染的血清免疫学指标有半乳甘露聚糖和1,3-β-D-葡聚糖,但特异度和灵敏度方面存在一定的局限性。Asp f3和Asp f4为烟曲霉主要抗原,在感染者血清中存在相应的循环抗体。本研究分别用兔抗Asp f3和Asp f4抗血清对其进行抗原表位扫描,鉴定了8个Asp f3和6个Asp f4最小表位基序肽。用所鉴定的最小表位基序与烟曲霉其他抗原的最小表位基序构建嵌合肽,可能有助于提高烟曲霉感染诊断的特异度和灵敏度。     

人类14—3—3ζ和GCH1蛋白相互作用的初步研究

目的寻找人类14-3-3ζ白的相互作用蛋白,为进一步揭示14-3-3ζ的作用机理提供线索。方法以14-3—3ζ为“诱饵”,利用酵母双杂交系统筛选人脑cDNA文库得到“猎物”蛋白,通过GSTpulldown技术和哺乳动物细胞内免疫共沉淀技术验证14-3-3ζ和“猎物”蛋白的特异性结合。结果首次利用酵母双杂交cDNA文库筛选技术发现了14-3-3ζ能够与GTP环化水解酶I（GTP cyclohydrolase1,GCHl）相互作用,并通过了体内和体外的蛋白质结合实验证实了这两个蛋白质之间的特异性相互作用。结论发现并验证了14-3-3ζ与GCH1之间的蛋白质相互作用,为进一步深入研究这两种蛋白质的功能及所引起的相关疾病的发病机理提供了新的线索。