人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的构建及验证

目的利用人源抗狂犬病病毒ScFv噬菌体抗体库,构建单克隆抗体(单抗)轻、重链质粒,瞬时表达,纯化后验证具有高中和活性的单抗。方法以从ScFv噬菌体抗体库中筛选获得特异性抗体为模板,PCR扩增抗体轻、重链可变区序列,构建人源全分子抗体瞬时转染质粒;轻、重链质粒混合后转染HEK293 EBNA1细胞,瞬时表达全分子抗体。采用Mabselect SuRe介质手动亲和纯化抗体,Nano Vue超微量分光光度计测定蛋白质的质量浓度,快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)进行体外中和效价验证。结果成功构建22个轻链质粒,15个重链质粒。通过真核细胞瞬时表达后,经手动亲和纯化后,获得22株单抗。除1株抗体外,其余21株抗体的蛋白质量浓度均>300μg/mL;部分抗体纯度均在90%以上。中和活性结果显示,5株在1 500~1 800 IU/mg之间;8株在800~1 500 IU/mg之间;7株在500~800 IU/mg之间;其余2株在500 IU/mg以下。结论成功构建并验证获得20株中和活性>500 IU/mg的人源抗狂犬病病毒单抗,为单抗混合制剂的研究奠定了基础。     

重组抗狂犬病病毒抗体在HEK293 EBNA1细胞中的瞬时表达优化

目的:优化重组抗体在悬浮无血清培养的HEK293 EBNA1瞬时表达,提高重组抗体表达量。方法:将HEK293 EBNA1细胞适应于无血清悬浮培养,筛选适宜的无血清培养基。使用PEI转染质粒进入细胞,瞬时表达重组抗体;使用Modde软件进行实验设计(DOE),优化转染质粒量、轻重链比例、PEI量等影响瞬时表达的条件。培养上清经亲和纯化,获得目标抗体,用快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)测定抗体活性,用BCA法测定纯化抗体浓度。结果:293SFMII为适宜的HEK293 EBNA1细胞无血清悬浮培养基。对抗体表达影响最大的因素是轻重链比例(P=0.00000),其次为质粒浓度(P=0.00086),最后为PEI(P=0.00257)。优化的转染条件为:质粒用量0.61μg/106细胞,轻重链比例2:1,PEI 2.67μg/106细胞,优化后抗体表达量有显著提高(P=0.007)。结论:通过DOE优化获得了重组抗狂犬病病毒抗体的高水平表达,抗体表达量提高了至少50倍。     

贵州雷公山国家级自然保护区鱼类物种多样性及其资源保护

2005年4月至2006年11月,对雷公山自然保护区的鱼类资源状况进行了调查.调查表明,保护区共有鱼类35种,隶属4目10科30属.该区的鱼类多数为适应于山区溪流生活的种类,鲤科鱼类是其中最大的类群,构成鱼类区系成分的主体.该区有一定经济价值的鱼类包括泥鳅(Misgurnus anguillicandatus)、马口鱼(Opsariichthys bidens)、鲤(Cyprinus carpio)、瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)、黄鳝(Monopterus albus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、刺鲃(Spinibarbus caldwelli)、南方白甲鱼(Onychostoma gerlachi)、月鳢(Channa asiatica)等.通过实地调查,对保护区内两条主要水系(长江水系和珠江水系)的物种相似度进行了对比.     

改良抗体结合实验检测灭活狂犬病疫苗效价

目的:建立抗体结合试验检测狂犬病疫苗(aG株)效价的方法。方法:将待检测疫苗与疫苗标准品梯度稀释后分别加入人抗狂犬病毒免疫球蛋白国家标准品中和1 h,之后加入80%感染剂量的狂犬病毒CVS-11,体外中和1h后接种BSR细胞,培养24 h后免疫荧光染色,在显微镜下观察结果,通过检测剩余病毒量计算待检疫苗的效价,同时与小鼠中和试验法(NIH法)测定狂犬病疫苗效价进行比较。结果:2种方法对8个样品效价的检测结果无显著统计学差异(P=0.997,配对t检验)。结论:初步建立了改良抗体结合试验,可用于狂犬病疫苗中间产品的质量控制。     

贵州雷公山海南鳽繁殖记录

海南鳽（Gorsachius magnificus）隶属于鹈形目（Pelecaniformes）鹭科（Ardeidae）,为我国Ⅱ级重点保护野生动物。本文报道了2019年5月至9月海南鳽 在贵州雷公山自然保护区干脑村南柳河（26?16? N,108?06? E,海拔771 m）的繁殖情况。海南鳽巢址选择在常绿阔叶林中,营巢于高大、枝叶繁茂、枝桠较多并有很强隐蔽性的阔叶树上。结合发现海南鳽幼鸟在贵州雷公山自然保护区分布区的增加,我们认为在贵州雷公山地区应该至少有1或2个繁殖种群。本次记录是海南鳽在贵州省的首次繁殖记录。     

三种淋巴瘤细胞CD52抗原呈现稳定性研究及其应用

评估淋巴瘤细胞MC/CAR、HUT78和RAMOS的CD52抗原呈现稳定性,并比较三种细胞用于抗CD52单抗活性检测中的优劣性。采用免疫荧光法检测淋巴瘤细胞MC/CAR、HUT78和RAMOS的CD52抗原呈现率,分析MC/CAR、HUT78和RAMOS传代培养5~20代CD52抗原呈现稳定性。分别以MC/CAR、HUT78和RAMOS作为抗CD52单抗结合活性和补体依赖细胞毒性的靶细胞进行检测,并比较其优劣性。结果显示,MC/CAR、RAMOS和HUT78的CD52抗原呈现率分别为95.5%、63.2%和38.3%。MC/CAR传代培养5~20代CD52抗原呈现率均大于90%。RAMOS传代培养5~13代CD52抗原呈现率介于60%~67%,第14~15代CD52抗原呈现率介于50%~60%,第16~20代细胞CD52抗原呈现率介于40%~50%。HUT78传代培养5~20代CD52抗原呈现率介于26.7%~38.9%。淋巴瘤细胞MC/CAR在抗CD52单抗的结合活性检测中呈现出更好的剂量依赖曲线。淋巴瘤细胞RAMOS在抗CD52单抗的补体依赖细胞毒性检测中呈现出更好的剂量效应曲线。CD52抗原呈现率方面MC/CAR>RAMOS>HUT78。结果表明,MC/CAR更适用于抗CD52单抗的结合活性的检测,RAMOS适用于抗CD52单抗的补体依赖细胞毒性检测。     

狂犬病毒单克隆抗体CHO细胞灌流培养中细胞特异性灌流速率的研究

目的 研究灌流培养中,不同的细胞特异性灌流速率(cell specific perfusion rate, CSPR)对狂犬病毒单克隆抗体CHO细胞生长及抗体蛋白表达的影响,摸索适合本细胞株灌流培养的CSPR。方法 在标号为CSPR 1～5[CSPR1;0.02 nL/(细胞·d)、CSPR2:0.03 nL/(细胞·d)、CSPR3:0.04 nL/(细胞·d)、CSPR4:0.05 nL/(细胞·d)、CSPR5:0.06 nL/(细胞·d),每组3个重复]的15个TPP管中按100万个/mL的初始密度接种相同的CHO种子细胞;摇床中,以转速225 r/min、CO₂浓度5.0%、湿度80%和温度37℃的条件培养细胞;以后每天取细胞样品,分别检测活细胞密度(viable cell density, VCD)、细胞活率、葡萄糖浓度、乳酸浓度和渗透压。接种3 d起,每天分别从CSPR 1～5的各管中,按0.02～0.06 nL/(细胞·d)的CSPR计算所需要更换的细胞悬液体积,将各管中的细胞悬液离心,取出相应体积的上清并补入相同体积的新鲜培养液重悬细胞后,继续培...     

丹参素注射液对急性心肌梗死大鼠的心室重构、心室功能及肢体导联与胸导联心电图参数的影响

摘要 目的：探讨丹参素注射液对急性心肌梗死大鼠的心室重构、心室功能及肢体导联与胸导联心电图参数的影响。方法：选择SD大鼠40只,将其鼠随机模型组、假手术组、硝酸甘油组、丹参注射液组。假手术组大鼠给予只在冠状动脉处穿针,不进行结扎,其余步骤同其余3组,其余3组均进行动物模型构建。假手术组、模型组大鼠均腹腔注射氯化钠注射液,硝酸甘油组腹腔注射硝酸甘油,丹参注射液组腹腔注射丹参注射液。对比4组大鼠的肢体导联与胸导联心电图参数,对比4组大鼠的血液流变学指标、左心室功能及左心室重构。结果：模型组的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVL、aVF、V1、V2、V5、血浆粘度、纤维蛋白原、红细胞聚集指数、舒张末期室间隔厚度、左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室舒张末期容积、左室收缩末期容积明显较假手术组、硝酸甘油组、丹参注射液组高,硝酸甘油、丹参注射液组以上指标明显较假手术组高,模型组的的左室舒张末期厚度、左室射血分数、左室短轴缩短率明显较假手术组、硝酸甘油组、丹参注射液组低,硝酸甘油、丹参注射液组的左室舒张末期厚度、左室射血分数、左室短轴缩短率明显较假手术组低。模型组的左心室重量指数、左心室截面直径明显较假手术组、硝酸甘油组、丹参注射液组高,硝酸甘油、丹参注射液组的左心室重量指数、左心室截面直径、梗死面积明显较假手术组高（P<0.05）,硝酸甘油组与丹参注射液组以上指标对比无差异（P>0.05）。结论：丹参素注射液可改善急性心肌梗死大鼠的心室重构、左心室功能及肢体导联与胸导联心电图参数,可能与其可降低大鼠的血液流变学指标水平有关。     

自然环境下雷山髭蟾卵群发育观察

2015年10月至2016年4月期间,在雷公山保护区内的雷公山工区对雷山髭蟾(Vibrissaphora leishanensis)在野外自然环境下卵群发育进行了观察。共发现产卵场14个,卵群54团。雷山髭蟾卵群从受精卵发育到鳃盖褶期的平均时间为(127.71±1.38)d(107~157 d,n=54),产卵场的气温、水温和水深对胚胎发育有一定影响。     

贵州发现寒露林蛙

2016年5月,在贵州雷公山国家级自然保护区南刀村(26°21′N,108°20′E,海拔1 400 m)采集到2只林蛙标本,经鉴定为寒露林蛙(Rana hanluica),为贵州省两栖动物新纪录。