用于腈纶表面改性的Corynebacterium nitrilophilus 腈水合酶的摇瓶发酵优化

通过毛细管效应、扫描电镜、染色实验等方法,考察了Corynebacterium nitrilophilus腈水合酶(nitrilre hydratase,NHase)在腈纶表面改性中的应用。结果表明,C. nitrilophilus腈水合酶处理后的腈纶纤维的润湿性及染料可染性分别比对照提高了43.5%和85.7%,说明该腈水合酶具有较好的腈纶纤维表面改性性能。为了提高用于腈纶表面改性的C. nitrilophilus腈水合酶的产量,采用单因素实验及正交实验在摇瓶上对碳源、氮源、诱导剂、金属离子等进行考察,获得较优的摇瓶发酵生产腈水合酶的条件:碳源采用葡萄糖,15 g/L;氮源采用酵母粉与氯化铵复配,浓度分别为3 g/L、1 g/L;诱导剂尿素的最适剂量为10 g/L;由于该腈水合酶是钴型酶,所以需在发酵过程中添加氯化钴,浓度为0.07 g/L。经过摇瓶优化,酶活由最初的16.2 U/ml提高到45.7 U/ml,提高了2.8倍。     

Thermococcus sp.B1001环糊精酶的重组表达及在麦芽七糖制备中的应用

成功构建pET-24a-tscd质粒,实现Thermococcus sp.Strain B1001来源的环糊精酶(TsCDase)在Es-cherichia coli BL21(DE3)中表达.通过热处理和镍柱分离对重组TsCDase进行纯化.酶学性质研究表明,重组TsCDase的比活为1 208.04 U/mg,最适温度为90℃、最适pH值为5.5.重组酶TsCDase在85℃、90℃、95℃条件下的半衰期分别为180、120、30min.酶转化研究表明,以80 g/L β-环糊精为底物,当酶转化温度为90℃、反应pH值为5.5～6.0,加酶量为25 U/g,反应时间为4 h时,麦芽七糖产率为81.19％和85.95％,七糖占产物麦芽寡糖的比例为95.24％和92.92％.本研究结果为工业化制备麦芽七糖奠定良好基础.     

复合与合成培养基对大肠杆菌胞外生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的影响

为实现来源于Paenibacillus macerans JFB05-01的α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-CGT酶）的高效胞外表达,以含分泌型信号肽OmpA的大肠杆菌E.coli BL21（DE3）{pET-20b（+）/α-cgt}为研究对象,比较了其在不同诱导条件下复合与合成培养基中生长产酶的规律。结果表明在添加甘氨酸的条件下采用合成培养基,以0.8 g/L/h的乳糖进行流加诱导所得的胞外酶活和生产强度最高。在该条件下发酵30小时后胞外α-CGT酶的环化活性达113.0U/ml（水解活性为79 100.0IU/ml）,是复合培养基胞外产酶的2.3倍,完全满足工业化生产的需求。     

微生物发酵法生产L-色氨酸的代谢工程研究

L-色氨酸作为人体内的一种必需氨基酸,广泛应用于医药、食品与饲料等行业.工业上采用的色氨酸生产方法有化学合成法、转化法及微生物发酵法.近年来,随着代谢工程在色氨酸菌种选育中的成功运用,微生物发酵法逐渐成为主要的色氨酸生产方法.系统综述了微生物发酵法生产色氨酸所涉及的代谢工程策略,包括生物合成色氨酸的代谢调控机制以及途径...     

纺织精练中碱性果胶酶稳定性的改进研究

从碱性果胶酶在纺织清洁生产中的应用条件出发,在60℃和pH 9.1左右,系统研究了不同稳定剂对提高碱性果胶酶的稳定性的影响。由此,得到了对酶稳定性作用较突出的添加剂以及复合稳定剂,较佳配方为乙酸钠6%(m/v)、MgCl2.2H2O 2%(m/v)。结果表明,添加稳定剂后的碱性果胶酶在棉织物精练中的应用特性得到了提高,达到了棉织物精练的需要。     

Thermobifida fusca角质酶突变体D204C/E253C高效可溶表达及其应用

Thermobifida fusca角质酶突变体D204C/E253C是通过在野生型角质酶中引入二硫键获得的热稳定性突变体.由于二硫键的引入,导致突变体D204C/E253C在表达过程中,易错误折叠形成大量包涵体,可溶表达比率极低.这极大地限制了其发酵制备以及在PET纤维改性中的应用.为了加强突变体D204C/E253C的可溶表达,本研究将突变体D204C/E253C和周质蛋白二硫键氧化还原酶DsbC在大肠杆菌突变株Es-cherichia coli Origami B(DE3)中共表达,来异构化异常的二硫键.实验结果表明,共表达的角质酶突变体D204C/E253C正常折叠表达,酶活为61 U/mL,是非共表达的6.8倍;共表达的突变体D204C/E253C在80℃的半衰期可达16 h,能够在80℃对PET纤维进行改性.本研究通过与分子伴侣蛋白DsbC在大肠杆菌突变株E.coli Origami B(DE3)中的共表达,实现角质酶突变体D204C/E253C的高效可溶表达,为大规模工业应用提供了一定的理论基础.     

Thermococcus sp.B1001环糊精酶的重组表达及在麦芽七糖制备中的应用

成功构建pET-24a-tscd质粒,实现Thermococcus sp.Strain B1001来源的环糊精酶(TsCDase)在Es-cherichia coli BL21(DE3)中表达.通过热处理和镍柱分离对重组TsCDase进行纯化.酶学性质研究表明,重组TsCDase的比活为1 208.04 U/mg,最适温度为90℃、最适pH值为5.5.重组酶TsCDase在85℃、90℃、95℃条件下的半衰期分别为180、120、30min.酶转化研究表明,以80 g/L β-环糊精为底物,当酶转化温度为90℃、反应pH值为5.5～6.0,加酶量为25 U/g,反应时间为4 h时,麦芽七糖产率为81.19％和85.95％,七糖占产物麦芽寡糖的比例为95.24％和92.92％.本研究结果为工业化制备麦芽七糖奠定良好基础.     

基于重组氧化葡萄糖酸杆菌生物合成吡咯喹啉醌

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一种重要的氧化还原酶辅基,具有多种生理生化功能,在食品、医药卫生及农业等领域具有广泛的应用。文中采用重组氧化葡萄糖酸杆菌生物合成吡咯喹啉醌。首先构建丙酮酸脱羧酶基因GOX1081敲除的重组菌G. oxydans T1,减少副产物乙酸的形成。然后利用筛选的内源性组成型启动子P0169融合表达pqqABCDE基因簇及tldD基因,构建重组菌G. oxydans T2。最后对发酵培养基添加物和发酵条件进行优化。结果显示重组菌G. oxydans T1、G. oxydans T2生物量较野生菌分别提高43.02%和38.76%,而PQQ的产量分别是野生菌的4.82倍和20.5倍。进一步优化G. oxydans T2碳源及培养条件,最终PQQ产量达(51.3241±0.8997)mg/L,是野生菌的345.62倍。通过基因工程手段,可以有效提高氧化葡萄糖酸杆菌的生物量和合成PQQ的产量,为改善PQQ生物合成效率奠定基础。     

发酵乳杆菌来源l-阿拉伯糖异构酶理性设计及在d-塔格糖生产中的应用

L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase,L-AI)是D-半乳糖异构化生成D-塔格糖的关键酶。为提高L-阿拉伯糖异构酶对D-半乳糖的活性及在生物转化中的转化率,本研究对发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CGMCC2921来源的L-阿拉伯糖异构酶进行重组表达和生物转化应用,并对其底物结合口袋进行理性设计以提高酶对D-半乳糖亲和力和催化活性。结果显示,突变体F279I对D-半乳糖的转化率提高至野生型酶的1.4倍,进一步叠加获得的双突变体M185A/F279I的K_m和k_cat分别为530.8mmol/L与19.9s^-1,底物亲和力显著提高,催化效率提高至野生型酶的8.2倍。以400 g/L乳糖为底物时,突变酶M185A/F279I转化率高达22.8%。本研究在乳糖高值化生产塔格糖方面具有重要的应用价值。     

角质酶在生物可降解聚酯聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯降解中的应用

随着废弃塑料带来的环境污染越来越严重,生物可降解聚酯已成为大众关注的焦点。聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯[poly(butylene adipate-co-terephthalate),PBAT]是脂肪族和芳香族共聚形成的生物可降解聚酯,兼具两者的优异性能。针对PBAT在自然条件下对降解环境要求严格且降解周期长的不足之处,本研究探究了角质酶在PBAT降解中的应用和对苯二甲酸-丁二醇酯(butylene terephthalate,BT)含量对PBAT生物降解性的影响,以实现对PBAT降解速率的提升。选取5种不同来源的聚酯降解酶对PBAT进行降解应用并比较出降解效果最优的酶,并测定了含有不同BT含量的PBAT聚酯的降解效率。结果表明,角质酶ICCG为降解效果最好的酶,且BT含量越高PBAT的降解率越低。此外,还确定了角质酶ICCG对高BT含量的PBAT(H)降解的最适温度、最适缓冲液类型、最适pH、最适E/S(enzyme to substrate)和最适底物浓度比分别为75℃、Tris-HCl、9.0、0.4%和1.0%。本研究结果可为角质酶在PBAT降解中的应用提供一定的理论依据和实验...