草鱼自噬相关基因Beclin1的克隆及其在MC-LR胁迫下的表达特征

为评估微囊藻毒素-LR (MC-LR)对鱼类自噬的影响, 根据转录组测序结果得到的EST序列, 采用RACE技术获得了草鱼(Ctenopharygodon idella)自噬基因Beclin1 (CiBeclin1)的cDNA全长序列。该基因序列全长1590 bp, 包括1344 bp的开放阅读框, 编码447个氨基酸, 分子量为51.2 kD, 理论等电点为4.88。CiBeclin1包含1个BH3和1个ECD结构域。CiBeclin1氨基酸序列与其他物种的相似性为88%—98%, 构建的进化树显示CiBeclin1与稀有鲫(Gobiocypris rarus)的Beclin1亲缘关系最近。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测结果表明, CiBeclin1在肝、肾、脾等10种不同组织中均广泛表达, 但在肝脏组织中的相对表达量最丰富, 显著高于相对表达量最低的头肾组织(P<0.05)。在不同剂量(25和100 μg MC-LR/kg BW) MC-LR胁迫24h、48h、72h和96h后, 草鱼肝脏中CiBeclin1表达量均显著低于对照组的表达水平, 研究结果表明, MC-LR能抑制草鱼CiBeclin1的表达, 但MC-LR是否在该剂量下诱导了草鱼的自噬还有待于进一步研究。     

异育银鲫GABA A受体γ2亚基全长克隆及生物信息学分析

近年来GABA A受体亚基特异性在药物筛选、研发过程中的应用得到广泛地关注,其中有关α1、β2和γ2三种功能性亚基的研究最为深入。异育银鲫因其良好的生长、繁殖优势,在国内得到广泛养殖。采用RACE法克隆得到了异育银鲫GABA A受体γ2亚基基因全长cDNA,并进行了生物信息学分析。该基因长2 763 bp,其中CDS区长1437 bp,可编码477个氨基酸的前体蛋白。预测蛋白分子量55.3 k D,理论等电点9.13。异育银鲫体内GABA A受体γ2亚基氨基酸序列N端存在1个长度为35个氨基酸的信号肽,4个长度分别为23、20、23和23个氨基酸的跨膜区,3个N-糖基结合位点和2个O-糖基化位点,1个特异性结构域,其氨基酸序列具有明显的氯离子门控通道家族特征。氨基酸序列与其他物种氨基酸序列的同源性都在89%以上,表明该蛋白属于GABA A受体亚基家族。系统进化树表明异育银鲫与斑马鱼聚为一支,亲缘关系最近。     

异育银鲫GABAB受体1亚基 cDNA部分序列的克隆及组织表达分析

为了确定γ-氨基丁酸B受体（gamma-aminobutyric acid B receptor,GABABR）基因在异育银鲫（Carassius auratus gibelio）不同组织中的表达,本实验分别对异育银鲫不同组织中GABABR1基因进行RT-PCR扩增,并进行了克隆和测序,在与GenBank基因库中已知GABABR1序列进行同源性比对的基础上采用邻接法构建系统发育树,并进一步分析其在异育银鲫不同组织内的表达水平。结果：经克隆获得异育银鲫GABABR1基因CDS区序列383bp,编码127个氨基酸。荧光定量PCR结果显示GABABR1基因在异育银鲫脑、肝、肾、心、肠、鳔、鳃、肌、鳍、脾、卵巢、精巢组织中均有表达,且在不同组织中的表达水平由高到低依次是：脑>尾鳍>精巢>心、肠、鳔> 卵巢、脾、鳃、肌>肝、肾。本研究证实了GABABR1基因在异育银鲫各组织中的表达的广泛性,且有明显的组织特异性。     

异育银鲫体内盐酸双氟沙星血浆蛋白结合率的变化与其药代动力学研究

为了研究盐酸双氟沙星(difloxacin, DIF)在异育银鲫体内血浆蛋白结合率的变化及其与药代动力学之间的关系, 实验采用超滤法测定了DIF在异育银鲫体内血浆蛋白结合率, 运用HPLC测定其对应时间点药物浓度, 并分析了血浆蛋白结合率变化对DIF体内处置的影响。实验以感染嗜水气单胞菌的异育银鲫为感染组, 健康异育银鲫为对照组。结果显示: 感染组各时间点DIF血浆蛋白结合率均高于对照组, 感染组与对照组DIF血浆蛋白结合率与总药物浓度呈对数关系: y=-9.01ln x+74.34和y=-4.81ln x+65.15, DIF血浆蛋白结合率与游离药物浓度的对数关系式分别为: y=-6.36ln x+64.91和y=-4.36ln x+ 60.63; 感染组和对照组血浆药时曲线均可使用开放性二室模型描述; 感染组DIF的吸收和消除慢于对照组, 其表观分布容积和曲线下面积大于对照组。结果显示异育银鲫体内感染嗜水气单胞菌促使DIF血浆蛋白结合率升高; 血浆蛋白结合率升高导致药物以结合药物的形式储存于血液中可能是导致药物组织分布受限、消除缓慢、长时间滞留于血液原因之一。     

基于GABA A受体评估双氟沙星对异育银鲫的安全性

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诺氟沙星壳聚糖微胶囊缓释作用研究

利用冷冻干燥法制备了诺氟沙星-壳聚糖微囊制剂,并比较了诺氟沙星-壳聚糖微囊制剂与诺氟沙星原料药在草鱼组织中代谢动力学的差异性。结果表明,同诺氟沙星原料药相比,壳聚糖包埋对诺氟沙星在草鱼血浆中的吸收、代谢速率明显延缓,生物利用度明显增加。壳聚糖包埋条件下T1/2 ka为单纯口灌诺氟沙星的8倍,达峰时间平均延长2倍有余,T1/2和T1/2也明显延长,消除率（CLs）是单纯口灌的1/2;5倍壳聚糖包埋条件下诺氟沙星在草鱼血浆中的吸收速度比10倍包埋条件下稍快,达峰时间短,消除速度明显加快,但分布半衰期和曲线下面积（AUC）大小二者比较接近。实验中诺氟沙星-壳聚糖微囊制剂同诺氟沙星原料药在草鱼体内代谢动力学差异表明壳聚糖包埋对诺氟沙星药效的释放及鱼体对药物的吸收代谢都具有明显的延缓效果,因此在实际的生产活动中可用壳聚糖作为缓释剂延长药效、延缓药物在养殖动物体内的吸收代谢,提高生物利用率,达到更好的预防和治疗效果。       

反硝化除磷菌筛选及其特性研究

【目的】研究反硝化除磷菌特性。【方法】通过微生物筛选和生物学特性研究方法,从对虾养殖池塘中筛选出多株可在有氧条件下同时具有反硝化除磷功能的菌种。【结果】菌株LY-1可在18 h内将初始量为10 mg/L的亚硝酸盐氮降低至0.04 mg/L,PO43?-P降低至0.05 mg/L。在DO浓度为5.0?5.9 mg/L时,该菌反硝化除磷率近100%。试验选取具有反硝化除磷功能的枯草芽孢杆菌为阳性对照菌,大肠杆菌为阴性对照菌,比较研究了菌株LY-1在不同pH、温度、盐度、PO43?-P浓度、亚硝酸盐浓度时反硝化除磷的强弱,在pH为5?9范围时,该菌亚硝酸盐氮去除率近99%,PO43?-P去除率86%;温度为30°C时,该菌反硝化除磷率近100%;盐度为5‰?15‰、PO43?-P浓度为10 mg/L、亚硝酸盐氮浓度为20 mg/L时,该菌亚硝酸盐氮和PO43?-P去除率均可达99%。【结论】菌株LY-1反硝化除磷性能显著高于对照菌(P<0.05)。通过菌株LY-1形态学观察、生理生化及16S rRNA基因序列分析,初步鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。     

草鱼IRE1-like基因的克隆、组织表达及其对微囊藻毒素-LR的响应

为了研究内质网应激相关基因需肌醇酶1(Inositol-requiring enzyme 1, IRE1-like)的结构和生物学功能及其在草鱼(Ctenopharyngodon idella)响应微囊藻毒素-LR(MC-LR)中的作用, 研究根据草鱼转录组测序结果得到该基因家族成员IRE1-like的EST序列, 采用RACE技术获得了草鱼IRE1-like基因的cDNA全长序列(登录号: MG797683)。该基因序列全长3595 bp, 包括3093 bp开放阅读框, 编码1030个氨基酸, 分子量为116.24 kD, 理论等电点为6.26, 具有跨膜结构和信号肽。草鱼IRE1-like基因包含Luminal (39—307 aa)、STKc (569—834 aa)和RNase (837—915 aa)三个结构域。同源性和系统进化树结果表明草鱼IRE1-like基因与斑马鱼IRE1-α基因亲缘关系最近。荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果表明, 草鱼IRE1-like基因在肝脏组织中的表达量最高, 在肌肉、脾脏、鳃和心脏等其他8种不同组织中也均有表达。不同剂量MC-LR诱导草鱼24h和96h后, 25 μg MC-LR/kg BW和100 μg MC-LR/kg BW剂量组中草鱼肝脏IRE1-like基因表达水平分别在24h和96h显著上升(P<0.05)。以上结果初步说明了草鱼IRE1-like基因可能在MC-LR诱导草鱼内质网应激中起着重要的作用, 为进一步研究草鱼IRE1-like基因的功能奠定了基础。     

异育银鲫GABAB受体1亚基cDNA部分序列的克隆及表达分析

为了确定γ-氨基丁酸B受体（gamma-aminobutyric acid B receptor,GABA_BR）基因在异育银鲫（Carassius auratus gibelio）不同组织中的表达,本实验分别对异育银鲫不同组织中GABA_BR1基因进行RT-PCR扩增,并进行了克隆和测序,在与GenBank基因库中已知GABA_BR1序列进行同源性比对的基础上采用邻接法构建系统发育树,并进一步分析其在异育银鲫不同组织内的表达水平。经克隆获得异育银鲫GABA_BR1基因CDS区序列383 bp,编码127个氨基酸。荧光定量PCR结果显示,GABA_BR1基因在异育银鲫脑、肝、肾、心、肠、鳔、鳃、肌、尾鳍、脾、卵巢、精巢组织中均有表达,且在不同组织中的表达水平由高到低依次是：脑>尾鳍>精巢>心、肠、鳔>卵巢、脾、鳃、肌>肝、肾。本研究证实了GABA_BR1基因在异育银鲫各组织中表达的广泛性,且有明显的组织特异性。     

草鱼TP53INP1基因的克隆及微囊藻毒素对其表达的影响

为深入研究肿瘤蛋白p53诱导核蛋白1(Tumor protein 53-induced nuclear protein 1, TP53INP1)的结构及其在微囊藻毒素-LR(MC-LR)胁迫下的表达变化, 以MC-LR诱导的草鱼(Ctenopharygodon idella)肝脏转录组测序获得的unigenes序列为基础, 扩增获得了TP53INP1基因的cDNA序列(GenBank登录号: MG797689), 其中开放阅读框(Open reading frame, ORF)为759 bp, 编码252个氨基酸, 属于β类型, 具有4个PEST结构。氨基酸同源性分析结果表明, TP53INP1具有较高的保守性, 其中与鱇浪白鱼(Anabarilius grahami)相似性最高。系统进化分析结果表明其与鱇浪白鱼(Anabarilius grahami)、斑马鱼(Danio rerio)等鱼类聚为一大支。采用荧光定量PCR分析发现TP53INP1基因在草鱼各组织中广泛分布, 其中, 在肝脏和血液等组织中表达丰富, 显著高于在头肾组织中的表达(P<0.05)。采用Western blot检测分析不同剂量(25、75和100 μg MC-LR/kg BW)MC-LR染毒96h后对草鱼肝脏TP53INP1蛋白的影响, 结果发现草鱼在100 μg MC-LR/kg BW剂量组中染毒96h后表达显著下降(P<0.05), 暗示TP53INP1可能在响应MC-LR胁迫中起着重要作用。研究为进一步了解TP53INP1的功能及为深入探讨TP53INP1在鱼类响应MC-LR胁迫后的作用机制提供了基础资料。