应用全外显子测序和显微切割技术识别1 例肺癌患者高频突变基因的异质性探索

目的:通过对一例肺鳞癌患者全外显子测序来识别这例肺癌的可能致病基因,并通过显微切割初步探索这例肺癌肿瘤细胞的起源与演化。方法:利用全外显子测序技术对肺癌肿瘤组织和相应癌旁组织测序;用COSMIC肿瘤数据库比较分析统计出肺癌可能致病基因;用激光显微切割技术提取五个不同部位肿瘤细胞;巢式PCR扩增,一代测序验证基因分型。结果:发现了这例肺癌病人的7个高频突变基因:LPHN2、TP53、MYH2、TGM2、C10orf137、MS4A3和EP300;这些基因在10×镜下和20×镜下经显微切割的肺癌组织的5个不同部位上的基因分型不同。结论:我们通过全外显子测序发现了这例肺癌的7个可能致病基因,并初步探索了这例肺癌肿瘤细胞是多克隆起源的。     

KEAP1基因及其突变位点对非小细胞肺癌细胞株作用的实验初步研究

摘要 目的：研究KEAP1基因及KEAP1基因突变位点对肺癌细胞株的作用。方法：通过Western blot 方法,比较携带KEAP1 基因突变的肺癌细胞株（A549,NCI-H460,NCI-H838）与KEAP1 基因野生型的肺癌细胞株（NCI-H292, NCI-H1299, 95D, SPC-A1）之间,NRF2基因与NRF2下游基因HO-1的蛋白表达水平,检测并比较两组细胞的活性氧（ROS）含量;以新发现的非小细胞肺癌（NSCLC）病人的 KEAP1 体细胞突变作为模板构建 KEAP1 突变质粒,对自身存在 KEAP1 突变的肺癌细胞株A549,通过改造的 pMSCV 逆病毒转染体系,分别构建过表达空载,野生型及突变型 KEAP1 的 A549 稳定细胞株,比较过表达不同质粒的细胞间丙二醛（MDA）含量及 NRF2 下游抗氧化等相关基因的表达水平;通过克隆形成实验检测细胞增殖情况。结果：KEAP1基因突变组肺癌细胞株与KEAP1基因无突变的对照组细胞株相比,NRF2和HO-1蛋白表达显著增高,活性氧水平显著降低（P<0.01）;过表达野生型KEAP1 与过表达空载的 A549细胞相比,NRF2 及其下游基因转录水平表达显著下降（P<0.01）,蛋白水平表达下降,细胞内丙二醛水平显著增高（P<0.01）,克隆形成率显著降低（P<0.01）,而过表达突变型 KEAP1 与过表达空载的 A549细胞相比,NRF2 及其下游基因表达、细胞内丙二醛水平、克隆形成率均无显著差异（P>0.05）。结论：KEAP1基因具有抑癌作用,其突变为失活型突变,突变后KEAP1/NRF2通路激活,KEAP1基因突变可能通过改变细胞的氧化应激水平,促进肺癌的发生发展。     

中国人群中16个已知肺癌基因突变的综合性分析

目的:对过去已知的肺癌基因在中国人群中的突变分布进行综合性的分析,指导肺癌的临床治疗。方法:通过文献查阅,挑选出16个已知的肺癌基因。在112例肺癌样本中,对这16个基因进行大样本的靶基因测序并用Sanger测序来验证。同时,对突变在不同亚组中的分布差异进行分析。结果:16个已知肺癌基因突变可评价60.4%肺癌样本。同时,这些基因的在不同的样本亚组中表现出不同的突变特点;通过功能域的分析及蛋白空间结构的模拟,发现9个可能的突变热点既位于蛋白的功能域内又能导致蛋白空间结构或者表面电荷分布的异常。结论:通过靶基因深度测序,全面分析了16个已知肺癌基因在肺癌不同亚组中的突变分布差异,发现并初步验证了9个可能的肺癌突变热点。     

前列腺素D2在小鼠哮喘模型中表达水平的研究

目的:探讨前列腺素D2在小鼠哮喘模型中的表达水平。方法:24只小鼠随机均分为四组:正常对照2周组,正常对照4周组,哮喘模型2周组,哮喘模型4周组。以卵白蛋白和氢氧化铝混悬液致敏,并予以卵白蛋白雾化激发建立哮喘小鼠模型。末次激发24h后,ELISA法检测其血清及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中前列腺素D2水平;收集BALF行嗜酸性粒细胞(eosinophil,EOS)计数;HE染色观察其肺组织病理改变。结果:与正常对照2周及4周组相比,哮喘模型组小鼠肺组织病理损害明显加重,EOS计数哮喘组显著高于正常组,差异有统计学意义(P0.05),血清及BALF中的前列腺素D2水平明显高于正常组,差异有统计学意义(P0.01),而且随着哮喘病程的延长,即哮喘模型4周组较2周组的肺组织病理损害更为严重,EOS计数升高更为显著,血清及BALF中的前列腺素D2增多更为明显,差异有统计学意义(P0.05)。但正常对照4周组与2周组比较,未见明显变化。结论:炎性介质前列腺素D2水平在哮喘模型中有一定的表达水平,而且随着哮喘病程的延长,前列腺素D2表达水平也逐渐升高。