L,D-转肽酶LdtMt2-厄他培南加合物的新状态Ⅰ-plus结构

具有多重耐药性和广泛耐药性的结核分枝杆菌菌株正在全球范围内传播,因此,迫切需要新的抗结核药物。结核分枝杆菌的L,D-转肽酶LdtMt2直接参与肽聚糖的形成,细菌毒性和β-内酰胺抗性。该酶是潜在的抗结核靶标,可以被碳青霉烯类抗生素抑制,碳青霉烯类抗生素是FDA批准的用于治疗肺结核的药物。据报道,LdtMt2与碳青霉烯类抗生素（如厄他培南,亚胺培南和美洛培南）相互作用时,存在两种不同的中间状态,即状态I和II。状态I被认为是初始加合物形成状态,而状态II被认为是稳定的蛋白质-配体相互作用状态,并伴有碳青霉烯类抗生素和蛋白质的局部构象排列。本文中,我们报告了一个LdMt2-ertapenem新中间状态I-plus,具有与状态II相同的碳青霉烯类抗生素构象和与状态I相似的局部蛋白质构象。该新状态是从状态I转变为状态II的中间状态,构象变化发生在厄他培南分子而不是蛋白质。我们的工作有助于阐明碳青霉烯类抗生素对LdtMt2的作用后发生的变化,并与其他报道的中间状态一起揭示L,D-转肽酶如何与碳青霉烯类抗生素相互作用。     

重组人PLCζ蛋白在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化及活性测定

PLCζ是PLC家族的一种新型同工酶,在哺乳动物卵母细胞激活中起着极其重要的作用。近年来,体外大量表达和纯化有活性的PLCζ蛋白用于结构生物学研究一直未能获得成功。本研究首次在杆状病毒表达系统中表达和纯化重组人PLCζ蛋白,首先将人PLCζ基因克隆至pFastBac-HTA质粒构建重组载体,转化DH10Bac发生位点特异性转座,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid-PLCζ;在脂质体介导下将穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞产生重组病毒,扩增病毒感染Sf9昆虫细胞进行蛋白表达;利用Ni~(2+)亲和柱及分子筛来纯化蛋白,并通过考马斯亮蓝染色、Western blotting及飞行时间质谱对蛋白进行鉴定,并进行酶活性测定。结果显示重组蛋白在Sf9昆虫细胞感染杆状病毒后72 h达到峰值并以分泌形式表达在细胞培养基中,Ni~(2+)亲和柱及分子筛纯化后的重组蛋白经Western blotting及电离飞行时间质谱鉴定为PLCζ蛋白,酶活性可达326.8 U/mL。该实验结果为重组人PLCζ蛋白大规模生产和生物医学应用研究提供了可参考利用的技术。     

人肠道梭菌和甲烷马赛球菌协同代谢甜菜碱和胆碱产甲烷研究

【目的】根据人肠道富含胆碱和甜菜碱,同时肠道微生物组中具有裂解胆碱和还原甜菜碱产三甲胺的细菌,以及利用三甲胺产甲烷的古菌,本研究探讨肠道细菌与古菌协同代谢甜菜碱和胆碱产甲烷的可能性。【方法】调查不同年龄段人群粪便中的16S rRNA基因多样性,分析肠道中古菌的菌群组成;利用定量PCR(quantitativePCR,qPCR)定量甲烷马赛球菌(Methanomassiliicoccus)特异的甲醇甲基转移酶基因mtaB和甲烷八叠球菌(Methanosarcina)及细菌的16SrRNA基因拷贝数,分析肠道中甲基营养型产甲烷古菌及总细菌的含量;宏基因组组装基因组(metagenome-assembled genomes, MAGs)分析携带甜菜碱还原酶基因grdH和胆碱裂解酶基因cutC的细菌组成。从粪便中分离代谢甜菜碱及胆碱产生三甲胺的细菌,并与分离自人肠道的甲烷马赛球菌构建共培养物,测定其协同转化甜菜碱和胆碱产甲烷的能力。【结果】年轻人粪便中含有甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae,82.16%)的甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter,49.18%)和甲烷...     

人肠道梭菌和甲烷马赛球菌协同代谢甜菜碱和胆碱产甲烷研究

【目的】根据人肠道富含胆碱和甜菜碱,同时肠道微生物组中具有裂解胆碱和还原甜菜碱产三甲胺的细菌,以及利用三甲胺产甲烷的古菌,本研究探讨肠道细菌与古菌协同代谢甜菜碱和胆碱产甲烷的可能性。【方法】调查不同年龄段人群粪便中的16S rRNA基因多样性,分析肠道中古菌的菌群组成;利用定量PCR(quantitative PCR,qPCR)定量甲烷马赛球菌(Methanomassiliicoccus)特异的甲醇甲基转移酶基因mtaB和甲烷八叠球菌(Methanosarcina)及细菌的16S rRNA基因拷贝数,分析肠道中甲基营养型产甲烷古菌及总细菌的含量;宏基因组组装基因组(metagenome-assembled genomes,MAGs)分析携带甜菜碱还原酶基因grdH和胆碱裂解酶基因cutC的细菌组成。从粪便中分离代谢甜菜碱及胆碱产生三甲胺的细菌,并与分离自人肠道的甲烷马赛球菌构建共培养物,测定其协同转化甜菜碱和胆碱产甲烷的能力。【结果】年轻人粪便中含有甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae,82.16%)的甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter,49.18%)和甲烷杆菌属(Methanobacterium,33.34%)、甲基营养型的甲烷八叠球菌科(Methanosarcinaceae,5.67%)的甲烷八叠球菌属(Methanosarcina,5.70%),以及甲烷马赛球菌科(Methanomassiliicoccaceae,3.13%)的甲烷马赛球菌属(Methanomassiliicoccus,3.14%)。而中老年人粪便中的甲烷古菌多样性较低,也未检测到甲烷马赛球菌。qPCR定量分析显示年轻人比中老年人肠道的总古菌含量高3.11倍,其中甲烷马赛球菌高6.53倍、甲烷八叠球菌高5.52倍,总细菌含量高2.90倍。宏基因组分析组装了229个细菌基因组,其中42个携带基因grdH和cutC,这些细菌属于毛螺菌科(Lachnospiraceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和梭菌科(Clostridiaceae)等。从粪便中分离到恶名梭菌(Clostridium malenominatum)B8,菌株B8与卢米尼甲烷马赛球菌(Methanomassiliicoccus luminyensis)B10共培养物可降解47.03%的甜菜碱和25.83%胆碱,并产生甲烷,在培养液中检测到三甲胺先积累后被降解。【结论】人肠道细菌恶名梭菌B8和卢米尼甲烷马赛球菌B10可协同代谢甜菜碱和胆碱产甲烷,推测它们在人肠道中可将部分食物中的甜菜碱和胆碱代谢产生甲烷。