表达昆虫特异性神经毒素AaIT基因的转基因烟草的抗虫性

经改造的昆虫特异性神经毒素AaIT基因插入植物高效表达载体得到重组质粒pNGY-2。重组质粒中AaIT基因5＇端与烟草花叶病毒(TMV)的Ω序列3＇端融合,受两个串联的35S启动子控制,通过土壤农杆菌LBA4404介导转化烟草NC89,经NPTⅡ选择后再经GUS染色挑选出阳性再生植株,Southern blotting进一步证实了AaIT基因已经整合到烟草基因组中,对棉铃虫(Heliothis armigera)的抗虫实验表明,转基因烟草有显著的抗虫活性。     

获得高抗虫转双基因烟草

利用DNA合成仪人工合成了豇豆胰蛋白酶抑制剂(cpTl)的cDNA编码全序列。合成的基因经过克隆和序列分析后．克隆到植物高效表达载体上,并转化农杆菌,通过共转化的方法,将cpTI基因和经人工改造的苏云金芽孢杆菌(B．T)δ－内毒素基因共转化烟草,得到经PCR扩增并Southern－blotting验证的分别含有CpTI和B．T基因的植株以及同时含有CpTI和B．T基因的植株。利用棉铃虫幼虫进行的杀虫测试表明．转基因烟草和对照烟草相比具有明显的杀虫活性-同时转双基因的烟草和转单一基因的烟草相比具有增强的杀虫活性。     

表达昆虫特异性神经麻痹毒素AaIT的杀虫杆状病毒的构建

根据杆状病毒核多角体基因及植物基因的密码子选择偏向、G+C含量和密码子第三位碱基的G+C含量,同时综合在真核系统中影响基因转录、翻译及影响mRNA稳定性等因素,在不改变所编码的氨基酸序列的基础上,设计并人工合成了昆虫特异性神经蝎毒素AaIT基因。合成的AaIT基因与合成的gp67信号肽DNA序列正确融合后通过杆状病毒转移载体pSXIV VI⁺X3体内重组到粉纹夜蛾多角体病毒(Trichoplusia ni nuclear polyhedrosis virus,TnNPV)上,得到重组病毒TnNPV-AaIT。经Southern blotting验证了AaIT基因整合在TnNPV基因组中,SDS-PAGE证明AaIT基因在重组病毒中的表达。通过用重组病毒口服感染供试昆虫,证明了含AaIT基因的重组病毒能显著缩短杆状病毒的杀虫时间,提高杀虫效率。这是迄今为止我国构建的第一株具有实用价值和应用前景的基因工程病毒。