miR-203下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化

目的:验证miR-203通过与TLR4 mRNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。方法:通过miRanda软件预测TLR4 mRNA 3'-UTR存在mi R-203结合位点。根据TLR4 mRNA 3'-UTR序列设计目的基因片段以及突变型目的基因片段,以pmirGLO为载体构建双荧光素酶报告基因野生型载体(pmirGLO-TLR4 3'-UTR)及其突变型载体(pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR)。将293T细胞共转染pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒或pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-mi R-203-3p mimics或mimic NC,通过双荧光素酶报告基因系统验证mi R-203可以与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合,通过Real-time PCR及Western blot验证小鼠巨噬细胞RAW264.7转染了mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC后,M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23),M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。使用TLR4抑制剂TAK-242抑制小鼠巨噬细胞TLR4-Myd88-NF-κB信号通路后,转染mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC,再次检测M1,M2型巨噬细胞markers及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。结果:双荧光素酶报告基因系统显示293T细胞转染了pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-miR-203-3p mimics后,其相对荧光素酶活性△CT较转染了pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒或者mimic NC均有显著降低,其差异达到统计学意义(P0.05)。Real-time PCR及Western blot显示转染了mmu-miR-203-3p mimics的小鼠巨噬细胞M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23)表达减少,M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)表达增加,同时伴有TLR4-Myd88-NF-κB信号通路表达下调,而通过给予TAK-242抑制了mmu-miR-203-3p mimics下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路及诱导M2型巨噬细胞极化的作用。结论:mi R-203与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。     

邻苯二甲酸二丁酯降低雄激素浓度导致尿道下裂发生机制研究

目的:验证邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是通过降低血清雄激素水平导致自噬异常激活,同时探讨DBP致子代大鼠尿道下裂发生的具体机制。方法:将孕鼠随机分为DBP染毒组与对照组,并于妊娠期14-18天通过灌胃的方式,分别用DBP(750 mg/kg/天)饲养DBP染毒,用等量花生油饲养对照组。依照此方法成功构建了子代新生大鼠尿道下裂模型。采集子鼠生殖结节(GT)用福尔马林保存,用免疫组织化学(IHC)染色观察生殖结节组织中自噬水平,即LC3B及Beclin1表达水平;在子鼠麻醉后采集血液标本,用放射免疫分析方法观测子鼠血清睾酮水平。在原代大鼠尿路上皮细胞(PUECs)基础上,用Western印迹方法检测有无双氢睾酮(DHT)对PUECs中LC3I、LC3II及Beclin1表达水平影响。结果:DBP染毒组尿道下裂发生率为42.3%,对照组子代无尿道下裂。DBP染毒组子代GT组织中自噬表达较对照组明显增加。DBP染毒组(n=10)较对照组中血清睾酮水平有明显差异(n=10)(P<0.05)。体外研究表明DHT缺乏组Beclin1及LC3蛋白转化率水平较对照组升高。结论:孕期暴露于DBP可以诱发子代尿道下裂发生,这可能是由于DBP降低子鼠雄激素水平促使自噬发生导致的,然而该疾病的机制仍需要进一步研究。     

孕期邻苯二甲酸二正丁酯暴露促进大鼠子代肾小管上皮细胞发生Snail1介导的上皮-间充质转化

目的:本实验以DBP暴露的大鼠为模型,研究DBP相关纤维化肾脏细胞上皮-间充质转化(EMT)水平改变以及该过程的调节机制。方法:动物模型中实验组妊娠大鼠在妊娠14-18天期间以800 mg/kg/天的剂量胃饲DBP,使用免疫组织化学(IHC)检测EMT相关指标;使用IHC、Western blot和PCR技术检测转录因子Snail1表达;以肾小管上皮细胞NRK52E作为体外模型,使用同样方法检测DBP暴露对中TGF-β1表达影响,检测H_2O_2对TGF-β1表达影响、TGF-β1信号通路拮抗剂对DBP诱导的Snail1表达的影响。结果:与对照组相比较,孕期DBP暴露导致子代肾脏E-cadherin指标显著升高,IHC染色强度超过对照组的3倍,N-cadherin指标显著下降,IHC染色强度约为对照组20%(P0.05)。DBP能够显著促进肾小管上皮细胞Snail1表达,IHC染色强度相比对照组升高约2.5倍(P0.05),干扰Snail1能够抑制DBP诱导EMT指标的改变;DBP暴露与肾脏TGF-β1高表达相关,TGF-β1信号通路抑制剂能够引起DBP相关的Snail1表达显著降低(约25%);此外,DBP造成的活性氧(ROS)产物累积促进了肾小管上皮细胞TGF-β1的表达(P0.05)。结论:孕期暴露于DBP会导致肾脏ROS产物累积和TGF-β1高表达,进而促进肾小管上皮细胞发生Snail1介导的EMT。