脐带血造血干/祖细胞体外分化为不同阶段红系祖细胞的动力学观察

目的:探讨体外培养脐带血单个核细胞定向诱导分化为不同阶段红系祖细胞的动力学变化情况。方法:用0.5%甲基纤维素沉降脐带血红细胞及人淋巴细胞分离液密度梯度离心法得到单个核细胞,在含EPO、SCF、IGF-1等细胞因子的无血清培养体系中诱导其定向分化为红系祖细胞,观察细胞增殖、存活率、细胞集落形成情况,并检测不同阶段细胞红系特异性表面标志CD71和CD235a的表达。结果:随着培养时间的延长,细胞数逐渐增多,14 d细胞可扩增140倍左右,收集诱导后的细胞进行瑞氏吉姆萨染色,可见大量红系祖细胞,诱导后的细胞集落形成能力强,形成的克隆大部分为红系集落。诱导过程中,14 d前CD71、CD235a的表达逐渐增高。按细胞表面标志表达的不同可将诱导的细胞分为4群,分别对应红系祖细胞的不同阶段;随着诱导天数的增加,各时间点细胞对应的早期红系祖细胞群(P2、P3)比例逐渐下降,中晚期红系祖细胞群(P4、P5)的比例逐渐上升。结论:无血清培养基添加细胞因子组合的红系诱导培养体系可较好地诱导扩增红系祖细胞,流式分选可获得相对均一而处于不同分化阶段的红系祖细胞群体。获得了红系祖细胞体外分化的动力学数据,为今后进一步优化红系诱导分化体系获得均一的红系祖细胞奠定了基础,并对未来利用干细胞制备均一的红系祖细胞应用于临床治疗有一定的指导作用。     

基因预测与PCR技术相结合从cDNA文库中获取表达基因的研究

应用计算机工具、GenScan软件预测中国美利奴绵羊MHC Class I区段的BAC文库中453oⅡ克隆的基因数目、特性及结构,建立一种可以从cDNA文库中简便有效获取表达基因的技术方法。选取4个预测基因作研究对象设计引物,应用PCR技术,对已构建好的cDNA文库进行PCR扩增,回收"目的基因"片段并连接pGEM-T载体,转DH5α大肠杆菌中扩增后测序。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,cDNA文库中有目的条带,测序结果与GenBank进行Blast分析,分析结果表明这些基因与羊的基因均具有99%以上的相似性。因此应用基因预测分析与PCR结合技术可简便迅速的从cDNA文库中获取表达基因。     

具有维持造血干/祖细胞能力的新型豆类凝集素的分离、纯化及功能鉴定

一种分离自豆类的新型凝集素不仅具有凝集活性,还具有体外长期维持造血干/祖细胞的能力.由眉豆（Dolichos lablab）中分离得到了这种多亚基的凝集素——FRIL（Flt3 receptor-interacting lectin）,并对它进行了核酸和蛋白质序列分析.免疫细胞分析显示,它的受体是CD34⁺造血干/祖细胞所特有的.在培养基中添加这种凝集素可长期维持CD34⁺细胞存活和增殖能力.以Flt3配基（FL）作为对照,在28天的培养时间内,相对于FL,FRIL可维持细胞较高的G0/G1期比例（80%以上G0/G1期）和长期培养中（14天以上）1.5倍以上的集落形成量.可见FRIL通过滞留造血干/祖细胞于G0/G1期而维持它们的自我更新潜能.     

不同区段HIV-1 env基因在Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统中的表达及检测

利用昆虫细胞杆状病毒表达系统,将从一株HIV-1阳性克隆质粒中获得的几个HIV包膜蛋白基因片段,克隆入转移载体中得到重组病毒.用此重组病毒感染昆虫细胞后表达出3种HIV包膜蛋白,即GP120-41P、GP41T、GP41P,分别含有HIV-1包膜糖蛋白GP120及部分GP41,删除了N端12个疏水氨基酸的GP41和仅有主要表位约240个氨基酸的GP41.收获后分别以Western-blotting和EIA检测,有较好的免疫学活性,其中GP41T的活性最强.该实验为HIV包膜蛋白的结构研究提供了依据,加以改进后可能有免疫检测的价值.     

红细胞成熟脱核机制的研究

面对解决血液来源匮乏的问题,开发新的血源已经成为当前医疗中的迫切需要,其中一种重要的手段就是体外产生功能性的红细胞,而脱核是关键的一步．虽然目前的研究表明已经可以在体外条件下产生成熟的脱核红细胞,但是诱导分化的效率相对比较低．不仅如此,我们对红细胞脱核机制研究的并不是很清楚．本文对于目前研究比较成熟的三种脱核理论,包括细胞凋亡学说、不对称分裂学说、膜泡运输理论,以及脱核过程中重要的蛋白质、microRNA进行了阐述,并对体外制备血细胞的前景进行了展望．     

高效诱导人胚胎干细胞成为内皮祖细胞

血管的发生和发育不仅对胚胎形成中各器官的发育分化十分重要,并且对成体的创伤修复和生殖功能也具有重要意义．血管内皮细胞是形成心血管封闭管道系统的形态基础,体外多种细胞可经诱导分化产生出内皮祖/内皮细胞(endothelial progenitor/endothelial cells,EPCs/ECs),但是存在一些不足．鉴于人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)诱导分化的全能性和长期增殖能力,为EPCs/ECs提供了新的来源．现有文献报道,hESCs诱导分化为EPCs/ECs的比例较低,为了提高该诱导分化效率,我们使用分阶段的二维诱导方法,首先将细胞接种在超纯层纤连蛋白(Matrigel)上,之后通过在不同阶段添加不同的因子,最终获得CD31⁺KDR⁺细胞的比例可以达到16%．进一步内皮诱导分化的结果显示,获得的EPCs/ECs的比例可以达到约32%,这些细胞具有在Matrigel上形成血管样结构的能力,可结合植物凝集素．实时定量PCR的结果显示,诱导分化所得的细胞表达众多内皮相关基因,并且免疫荧光的结果也表明部分细胞表达内皮细胞特异性表面标志CD31．     

逆转录病毒介导的稳定表达E4orf1和绿色荧光蛋白的胎肝窦内皮细胞株的建立

目的:为构建优化的内皮细胞用于造血干细胞(HSCs)的支持培养,通过逆转录病毒载体系统建立稳定表达腺病毒E4区开放读框1(E4orf1)和绿色荧光蛋白(GFP)的人胎肝窦内皮细胞(HFLSECs)株。方法:利用Plat-A细胞将质粒MSCV-N E4orf1和p MX-GFP分别包装为逆转录病毒,共同感染HFLSECs,将原代培养的HFLSECs和转基因的HFLSECs分别在含有0.5、1、2、4μg/m L嘌呤霉素的EGM-2培养基中培养,以测试最适药物筛选浓度,药筛1周后通过流式细胞分选获得稳定转染E4orf1的GFP~+HFLSECs(E4orf1-GFP/HFLSECs)。通过密度梯度离心法从脐带血中分离单个核细胞,利用免疫磁柱分选获得CD34~+造血干/祖细胞(HSPCs),以E4orf1-GFP/HFLSECs作为饲养层联合SCF、TPO、Flt-3L等3种基础造血相关因子进行体外扩增和半固体造血细胞集落培养。结果:0.5μg/m L嘌呤霉素在5 d内即能完全杀死HFLSECs,而转基因的HFLSECs可以正常存活,以此药物浓度加压筛选1周,后续通过流式分选GFP阳性细胞,阳性率为90.5%,在E4orf1-GFP/HFLSECs饲养层支持下,人脐带血来源的CD34~+细胞15 d扩增了360倍,是单纯细胞因子悬浮培养组的2.2倍,且扩增后的HSPCs在体外仍具有多种造血集落形成能力。结论:该细胞株的建立将为构建造血干细胞体外培养体系及研究造血细胞的发育分化提供适宜的微环境。     

Wnt3a 转基因基质细胞的建立及其对脐血CD34+ 造血干/祖细胞扩增作用的研究

Wnt 信号通路在造血干/祖细胞自我更新的过程中发挥至关重要的作用 . 纯化的 Wnt3a 蛋白可以实现造血干/祖细胞的扩增 . 通过病毒转染原代小鼠骨髓基质细胞,建立转基因滋养层细胞 . 通过共培养对转基因滋养层细胞扩增 CD34+ 造血干/祖细胞的作用进行了研究 . 实验结果显示 , 与普通滋养层加细胞因子组相比,经转基因滋养层加细胞因子组培养的 CD34+造血干/祖细胞集落形成能力 (CFC) 是其 (1.55±0.06) 倍;混合集落形成能力是其 (1.95±0.26) 倍;高增殖潜能集落形成能力 (HPP-CFC) 是其 (1.45±0.40) 倍; LTC-IC 活性是其 (3.83±0.86) 倍 . 结果表明,转基因滋养层细胞通过分泌具有天然活性的 Wnt3a 蛋白能在体外有效地扩增造血干/祖细胞的数量 .     

中国菰资源研究现状及应用前景

中国菰(Zizania latifolia(Griseb.)Turcz.ex Stapf)是一种多年生禾本科稻亚科稻族菰属挺水植物。研究表明,菰具有现代水稻栽培品种所需要的许多优良性状,在生态治理方面表现出应用潜力;菰米营养价值高于普通稻米,且兼具保健功效。菰的这些特性使其在水稻种质改良、重金属离子污染土壤治理以及功能性食品开发方面表现出诱人的前景。近年来,菰属植物的研究工作取得了一定的进展,主要涉及菰的起源进化、菰的经济价值、菰与生态环境的关系、菰遗传多样性分析、菰组学及育种应用等五方面。因文献报道的时间跨度大,涉及面广,目前未见详尽的有关该物种研究进展的专门论述。本文从上述5个方面进行总结,促进对菰的了解,为这种重要野生资源的研究、保护和开发利用提供借鉴,进而加速该物种的研究进程。     

一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用

构建的pTO-T7大肠杆菌高效融合表达载体,调控序列中有一个Ω序列和一个T7启动子串联;多克隆位点(MCS)包括8个常用酶切位点;可进行融合表达或者非融合表达,根据不同的需要加以选择;融合蛋白N端为T7g10的12个起始氨基酸,C端为His标签;含kan抗性基因作为选择标记。将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆至pTO-T7载体,在E.coli中的表达结果表明,融合EGFP达到菌体总蛋白量的50%以上,90%以上的融合蛋白以可溶性形式存在,融合后的EGFP仍保持原有的荧光性质。与同时构建的不含Ω序列的pT-T7载体的表达产量的比较研究结果表明,Ω序列在pTO-T7载体中能显著提高表达效率。