羰基生物还原法合成手性醇的研究进展

手性醇是合成许多光学活性药物、农用化学品及其他精细化学品的关键手性砌块。羰基生物还原法理论上可实现100%转化率,且反应条件温和,对环境十分友好,被普遍认为是生产手性醇的绿色、高效途径。综述了近年来利用生物信息学、高通量筛选和蛋白质工程的发展对新型、高效生物催化剂开发的影响,特别是利用相关技术手段开发羰基还原酶的进展。     

arcA基因提高大肠杆菌对有机溶剂的耐受性

【目的】将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida JUCT1)的基因arc A(编码精氨酸脱亚胺酶)整合到Escherichia coli JM109(DE3)基因组中,以提高该菌对有机溶剂的耐受性。【方法】以P.putida JUCT1的基因组为模板扩增基因arc A,并与p ET-20b(+)连接后导入E.coli JM109(DE3)中,验证该基因提高E.coli JM109(DE3)对有机溶剂的耐受性。利用Red同源重组的方法将arc A整合到E.coli JM109(DE3)基因组中。【结果】E.coli JM109(DE3)/p ET-20b(+)-arc A在添加了2.0%(体积比)环己烷、0.1%(体积比)甲苯、4.0%(体积比)萘烷和0.1%(体积比)丁醇的培养基中培养8 h后,其OD660由初始的0.2分别上升到0.8、0.9、1.8和1.3。将arc A成功整合到E.coli JM109(DE3)基因组中,获得了具有较好遗传稳定性的溶剂耐受E.coli JM109(DE3)宿主菌株。【结论】外源基因arc A能提高大肠杆菌菌株的有机溶剂耐受性,为工业化应用中耐溶剂微生物菌株的构建提供了实验依据和理论基础。     

精细化学品绿色合成用工具酶酌定向开发

近年来随着人们环境保护意识的增强以及对可持续发展技术的追求,使得以绿色环保为特色的生物催化技术越来越受到人们的关注。生物催化剂作为生物催化技术的工具,发挥着至关重要的核心作用。本文综述了生物催化技术发展各个阶段生物催化剂定向开发的最新进展。     

谷氨酸棒状杆菌CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除技术的比较

【背景】谷氨酸棒状杆菌的基因敲除系统较为匮乏且效率不高,难以对其进行代谢工程改造,不利于高性能工业菌株的构建及规模生产。【目的】分别采用CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除系统对谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(CorynebacteriumglutamicumATCC13032)基因组上的argR和argF基因进行敲除,比较两种敲除方法的优缺点,为合理选择敲除系统提供依据。【方法】特异性重组的Cre/loxP敲除系统是首先利用同源重组将基因组上的靶基因替换为两端带有重组位点loxP的kanR片段,然后由重组酶Cre识别loxP位点并发生重组反应,从而去除替换到基因组上的kanR片段,进一步利用质粒的温敏特性将其消除,从而实现靶基因的敲除。CRISPR-Cpf1敲除系统是利用Cpf1对pre-crRNA进行加工,形成的成熟crRNA引导Cpf1识别和结合到靶DNA的特定序列上并切割双链DNA分子,通过同源重组作用去除靶基因,基于质粒自身的温敏特性将其消除,从而完成基因敲除的整个过程。【结果】Cre/lox P系统可在8N+2 d内完成N轮迭代基因敲除,而CRISPR-Cpf1系统可在5N+2d内完成N轮迭代基因无痕敲除,理论上还可以一次对多个靶位点进行编辑,效率更高,但存在同源重组效率较低、假阳性率高等缺点。【结论】与Cre/loxP系统相比,CRISPR-Cpf1辅助的同源重组基因敲除方法可省时、省力地实现基因的无痕敲除,理论上还可实现多个基因的同时敲除、总体效率更高,然而编辑效率还有提高的空间。     

糖丁基梭菌产丁醇途径在大肠杆菌中的构建及发酵

摘要:【目的】通过克隆来源于糖丁基梭菌(Clostridium saccharobutylicum DSM13864)丁醇合成途径的关键酶基因(thlA,bcs-operon和adhE),构建产丁醇大肠杆菌。【方法】以Clostridium saccharobutylicum DSM13864的基因组为模板,分别扩增丁醇途径关键酶基因thlA,bcs-operon(crt-bcd1-etfB2-fixB2-hbd)和adhE,构建了两个重组质粒pETDuet-bcs和pRSFDuet-thlA-adhE,并成功转入E.coli JM109(DE3)实现异源表达,使大肠杆菌具备产丁醇能力。在半厌氧条件下进行重组菌的发酵,并研究不同培养基对产丁醇的影响。【结果】该重组菌在半厌氧条件下经摇瓶发酵丁醇产量达到25.4 mg/L,通过优化培养基后,在TB发酵培养基中丁醇产量可达到34.1 mg/L。【结论】通过构建重组共表达质粒,将糖丁基梭菌来源的丁醇途径关键酶基因在大肠杆菌中表达,成功构建产丁醇大肠杆菌。该研究提供了一株易于操作的丁醇发酵重组大肠杆菌,避免了传统梭菌发酵丁醇生产中苛刻的厌氧条件、易产孢子等限制问题。     

基于膜压力应答途径的大肠杆菌丁醇耐受性

【目的】筛选丁醇压力下Escherichia coli中参与溶剂压力应答的细胞信号传导途径,并从应答途径出发,提高E.coli丁醇耐受性。【方法】在丁醇压力下,利用RT-PCR分析大肠杆菌内膜压力应答途径中反应调节因子(response regulator,RR)的表达水平,通过Red同源重组以及一步克隆的方法分别构建外膜脂蛋白Nlp E和分子伴侣蛋白Spy的敲除菌株E.coli JM109(Δnlp E)和E.coli JM109(Δspy)及重组菌株E.coli JM109/p QE80L-nlp E和E.coli JM109/p QE80L-spy,并测定其溶剂耐受性和细胞膜疏水性。【结果】0.8%(V/V)丁醇处理10 h后,Cpx和Bae双组分压力应答途径中的cpx R和bae R基因的表达水平分别提高了8.3和3.3倍;分别在含0.6%(V/V)四氢呋喃、0.1%(V/V)甲苯和0.6%(V/V)环己烷的培养基中培养10 h后,重组菌株E.coli JM109/p QE80L-spy和E.coli JM109/p QE80L-nlp E的OD600相比对照组(OD600增长0.02-0.04)分别增长了0.13-0.17和0.05-0.13,重组菌的溶剂耐受性得到了显著提高。【结论】Cpx和Bae系统参与大肠杆菌丁醇压力应答,分子伴侣蛋白Spy的过表达能够有效提高大肠杆菌对有机溶剂的耐受性,本研究为阐明微生物有机溶剂耐受性机制提供了理论依据。     

高产小麦旗叶细胞结构与产量关系的研究

本文旨在揭示小麦旗叶结构与产量的关系.通过时四个品种小麦旗叶进行离析、显微观察、拍照、数据统计,并计算出叶肉细胞环数的期望,分别作了同产量的相关分析和回归分析.结果表明,气孔密度、气孔面积、表皮细胞面积、叶肉细胞环数的期望同产量呈正相关关系,并建立了同产量的回归方程.