猪链球菌2型ABC转运蛋白gene0910敲除突变体的构建及活性分析

目的:构建猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)强毒株05ZYH3389K毒力岛上的ABC转运蛋白gene0910敲除突变体,并初步分析其活性,为进一步研究猪链球菌假想毒力因子在致病中的作用提供实验基础。方法:以猪链球菌2型05ZYH33基因组为模板,扩增gene0910两侧各约500bp左右的片段为上下游同源臂,以pSET1质粒为模板,扩增氯霉素抗性基因Cm为中间片段,采用重叠PCR方法搭建三个片段,并克隆到自杀载体pSET4S上,构建基因敲除的载体。电转化05ZYH33感受态细胞,经30℃双交换和40℃质粒丢失,最后点板法筛选出基因敲除突变体△0910。对突变株和野生株的生物学活性及小鼠的致病性进行了初步比较。结果:PCR分析和测序结果均显示gene0910完全被氯霉素抗性基因Cm所替代,基因敲除突变体构建成功。结论:突变株的生物学活性和对小鼠的致病性与野生株相比差异不显著。     

重组人神经生长因子rh-β-NGF真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

为大量制备β-NGF,构建了一种稳定、高效表达重组人神经生长因子(Recombinant human nerve growth factor,rh-β-NGF)的真核表达载体及含该重组载体的HEK293细胞株。首先,构建重组质粒p CMV-β-NGF-IRES-dhfr并转染至HEK293细胞系,用MTX加压筛选和有限稀释法进行选择,获得高效表达rh-β-NGF的单克隆重组细胞株;随后逐步降低血清培养,最终使细胞株完全适应无血清培养基并稳定表达rh-β-NGF;SDS-PAGE分析该表达产物,可见相对分子质量约13 k Da的条带,纯度大于50%,经质谱法测定得到其肽图谱与理论序列完全匹配,接着利用离子交换层析和分子筛层析纯化rh-β-NGF;最后进行重组细胞株表达效率和表达稳定性检测,表明重组细胞株可稳定、高效表达rh-β-NGF,其分泌效率大于20 pg/(cell?d),并能诱导PC12细胞的分化,具有良好的生物学活性。     

天然属性抗LDL及oxLDL IgM亚类抗体的制备与鉴定

目的：制备天然属性抗低密度脂蛋白（LDL）及抗氧化低密度脂蛋白（oxLDL）IgM亚类抗体。方法：给予Babl/c小鼠高胆固醇饮食,4周后取脾细胞直接与SP2/0细胞融合,以纯化的LDL及oxLDL为抗原,对阳性杂交瘤细胞生长孔进行间接ELISA筛选。鉴定杂交瘤上清的免疫球蛋白亚类,进而采用免疫沉淀和免疫印迹法对获得的抗体进行免疫学反应性鉴定。结果：杂交瘤细胞分泌的抗LDL及抗oxLDL的天然抗体通过ELISA法被筛选出来,可以与LDL或oxLDL发生高亲和力结合,经过4次克隆化,最终获得2株稳定分泌天然抗LDL的抗体,命名为5G8和2H7,及1株稳定抗oxLDL的抗体,命名为3A6,3株抗体均属于IgM亚类,无交叉反应,可以满足免疫印迹、免疫沉淀等实验要求。结论：成功制备了抗LDL及抗oxLDL IgM亚类抗体,为研究天然抗体在体内脂质代谢和相关心脑血管疾病如动脉粥样硬化等发生发展中的作用提供了重要的研究工具。     

城市尺度的城乡建设用地潜力及空间格局匹配评价——以南昌市为例

随着经济快速发展和城镇化进程不断加快,土地开发强度日益增大,导致生态环境不断恶化,分析城乡建设用地承载能力及空间格局匹配情况,对解决土地利用不合理、生态破坏等问题具有重要意义。以江西省南昌市为例,首先从生态安全、自然条件、社会经济等方面构建指标体系,采用层次分析法和限制系数评价模型,进行城乡建设用地开发适宜性评价,然后测算城乡建设用地承载力、可承载城乡建设用地丰度;最后与现状城乡建设用地进行空间匹配度分析,并探讨可承载临界值、丰度与空间匹配度的相关性。结果表明：南昌市城乡建设用地最适宜区、较适宜区、较不适宜区和不适宜区面积分别为1466.19、1346.01、353.69 km²和3770.70 km²;研究区城乡建设用地可承载临界值和可承载潜力分别为41.25%和24.05%,各县（区）值差异较大,各县（区）可承载临界值和可承载潜力范围分别为19.43%-98.71%和5.65%-49.83%,可承载城乡建设用地丰度情况良好,各县（区）值介于0.19-1.50之间;研究区各县（区）空间匹配度范围为67.41%-99.25%;相关分析显示,空间匹配度与城乡建设用地可承载临界值和可承载城乡建设用地丰度均呈正相关关系。研究可为南昌市城乡建设用地合理开发利用和国土空间优化提供依据。     

海洋沉积物中铁还原细菌组成及异化铁还原与产氢性质分析

【背景】一些铁还原细菌具有异化铁还原与产氢的能力,该类细菌在环境污染修复的同时能够解决能源问题。【目的】从海洋沉积物中富集获得异化铁还原菌群,明确混合菌群组成、异化铁还原及产氢性质。获得海洋沉积物中异化铁还原混合菌群组成,分析菌群异化铁还原和产氢性质。【方法】利用高通量测序技术分析异化铁还原菌群的优势菌组成,在此基础上,分析异化铁还原混合菌群在不同电子供体培养条件下异化铁还原能力和产氢性质。【结果】高通量数据表明,在不溶性氢氧化铁为电子受体和葡萄糖为电子供体厌氧培养条件下,混合菌群的优势菌属主要是梭菌(Clostridium),属于发酵型异化铁还原细菌。混合菌群能够利用电子供体蔗糖、葡萄糖以及丙酮酸钠进行异化铁还原及发酵产氢。葡萄糖为电子供体时,菌群累积产生Fe(Ⅱ)浓度和产氢量最高,分别是59.34±6.73 mg/L和629.70±11.42 mL/L。【结论】异化铁还原混合菌群同时具有异化铁还原和产氢能力,拓宽了发酵型异化铁还原细菌的种质资源,探索异化铁还原细菌在生物能源方面的应用。     

猪链球菌2型全基因组DNA芯片的研制及基因表达谱技术平台的建立

目的：研制猪链球菌2型（SS2）全基因组DNA芯片,建立SS2基因表达谱技术平台。方法：利用SS2全基因组序列,挑选出2194条基因,经PCR扩增出2156条基因并将产物纯化,点样制备芯片;将芯片用于表达谱研究,采用实时定量PCR验证表达谱结果,对芯片进行可靠性分析。结果：芯片杂交数据与实时定量PCR验证显示了较高的相关性,二者相关系数r=0.87。结论：研制了一批SS2全基因组DNA芯片,并建立了基于DNA芯片的表达谱技术平台。     

基于pDS132的基因敲除中创伤弧菌氯霉素的耐药性变化及影响

【背景】基于自杀载体的基因敲除在单基因敲除上的应用较为常见,但在多基因敲除过程中细菌耐药性的变化及对后续敲除的影响尚未明确。【目的】探究基于自杀载体pDS132的创伤弧菌vvhA与rtxA1双基因敲除株构建过程中,创伤弧菌对氯霉素耐药性的变化及对后续基因敲除的影响。【方法】基于自杀载体pDS132的同源重组法构建创伤弧菌YJ016的单基因敲除株YJ016-ΔvvhA、YJ016-ΔrtxA1和双基因敲除株YJ016-ΔvvhAΔrtxA1,记录单交换筛选时的氯霉素浓度与筛选平板上成功重组的菌株所占比例。琼脂稀释法测定野生型与敲除株的氯霉素最低抑菌浓度(Minimum InhibitoryConcentration,MIC)和抗性突变频率,纸片扩散法测定菌株对其他药物的敏感性,分析其对单交换筛选的影响。【结果】单基因敲除株的氯霉素MIC及氯霉素抗性突变频率高于野生型;双基因敲除株的庆大霉素抑菌圈直径小于野生型。单基因敲除时,单交换重组菌株的占比为100%(20/20);在YJ016-ΔvvhA上敲除rtxA1基因,氯霉素筛选浓度为2、4μg/mL时,单交换重组菌株的占比分别为40%(8/20)、5%(1/20);在YJ016-ΔrtxA1上敲除vvhA基因,氯霉素筛选浓度为2、4μg/mL时,单交换重组菌株的占比均为0%(0/20)。【结论】基于自杀载体pDS132的基因敲除中创伤弧菌氯霉素的耐药性升高,可能影响后续单交换重组的筛选,该结果为基于自杀载体的同源重组技术应用于多基因敲除提供了参考。     

异化铁还原细菌LQ25还原重金属Cr (VI)的特性研究

[背景] 异化铁还原细菌能够在还原Fe （III）的同时将毒性较大的Cr （VI）还原成毒性较小的Cr （III）,解决铬污染的问题。[目的] 基于丁酸梭菌（Clostridium butyricum） LQ25异化铁还原过程制备生物磁铁矿,开展异化铁还原细菌还原Cr （VI）的特性研究。[方法] 构建以氢氧化铁为电子受体和葡萄糖为电子供体的异化铁培养体系。菌株LQ25培养结束时制备生物磁铁矿。设置不同初始Cr （VI）浓度（5、10、15、25和30 mg/L）,分别测定菌株LQ25对Cr （VI）还原效率以及生物磁铁矿对Cr （VI）的还原效率。[结果] 菌株LQ25在设置的Cr （VI）浓度范围内都能良好生长。当Cr （VI）浓度为15 mg/L时,在异化铁培养条件下,菌株LQ25对Cr （VI）的还原率为63.45%±5.13%,生物磁铁矿对Cr （VI）的还原率为87.73%±9.12%,相比菌株还原Cr （VI）的效率提高38%。pH变化能影响生物磁铁矿对Cr （VI）的还原率,当pH 2.0时,生物磁铁矿对Cr （VI）的还原率最高,几乎达到100%。电子显微镜观察发现生物磁铁矿表面有许多孔隙,X-射线衍射图谱显示生物磁铁矿中Fe （II）的存在形式是Fe （OH）₂。[结论] 基于异化铁还原细菌制备生物磁铁矿可用于还原Cr （VI）,这是一种有效去除Cr （VI）的途径。     

虾夷扇贝雄核发育单倍体的人工诱导研究

人工雄核发育,是利用遗传失活的卵子与正常精子受精,再利用染色体加倍技术使受精卵恢复为二倍体的遗传操作技术。利用该技术可大大加速品系纯化的过程,对遗传育种学研究有重要意义。目前有关鱼类雄核发育的研究已见于鲤(Gyprnus carpio)[1,2]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[3]、红点溪鳟(Salvelinus fontinalis)[4]、泥鳅(Misgurnus anguilicaudatus)[5,6]、斑马鱼(Danio rerio)[7]、马苏大麻哈鱼(Oncorhynchus masou)[8]等种类。人工诱导贝类雄核发育的研究资料在国内外都很少,目前只有栉孔扇贝和太平洋牡蛎雄核发育诱导条件及其发育早期…