过表达和敲减ace-miR-3720对中华蜜蜂工蜂幼虫肠道的靶基因表达和重量的影响

【目的】本研究旨在明确ace-miR-3720在中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道发育中的功能,并为进一步探究ace-miR-3720调控肠道发育的分子机理提供理论和实验依据。【方法】根据ace-miR-3720的核苷酸序列设计合成相应的模拟物mimic-miR-3720和抑制物inhibitor-miR-3720,通过饲喂中华蜜蜂工蜂幼虫对ace-miR-3720分别进行过表达和敲减。采用RT-qPCR检测过表达和敲减ace-miR-3720后4-6日龄幼虫肠道内ace-miR-3720及其靶基因CKⅠ, MAPK1和βGBP1的相对表达量;使用分析天平称重过表达和敲减ace-miR-3720后的幼虫肠道重量。【结果】相较于无义模拟物(nonsense mimic, mimic-NC)组,mimic-miR-3720组中ace-miR-3720表达量在中华蜜蜂4和5日龄幼虫肠道中均极显著上调,在6日龄幼虫肠道中显著上调;相较于无义抑制物(nonsense inhibitor, inhibitor-NC)组,inhibitor-miR-3720组中ace-miR-3720表达量在4日龄幼虫肠道中极显著下调,在5和6日龄幼虫肠道中显著下调。ace-miR-3720与基因CKⅠ, MAPK1和βGBP1之间存在潜在靶向关系。与mimic-NC组相比,mimic-miR-3720组中CKⅠ表达量在4和5日龄幼虫肠道中皆极显著下调,在6日龄幼虫肠道中显著下调;MAPK1表达量在4日龄幼虫肠道中显著下调,在5和6日龄幼虫肠道中均极显著下调;βGBP1表达量在4日龄幼虫肠道中显著下调,在5和6日龄幼虫肠道中均极显著下调;此外,4和5日龄幼虫肠道重量均极显著降低,6日龄幼虫肠道重量显著降低。与inhibitor -NC组相比,inhibitor-miR-3720组中CKⅠ表达量在4-6日龄幼虫肠道中皆极显著上调;MAPK1表达量在4日龄幼虫肠道中显著上调,在5和6日龄幼虫肠道中极显著上调;βGBP1表达量在4和6日龄幼虫肠道中显著上调,在5日龄幼虫肠道中极显著上调;此外,4和6日龄幼虫肠道重量显著升高,5日龄幼虫肠道重量极显著升高。【结论】ace-miR-3720在中华蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在;通过饲喂模拟物和抑制物可对中华蜜蜂工蜂幼虫肠道内分别实现miRNA的有效过表达和敲减;ace-miR-3720可能通过调控CKⅠ, MAPK1和βGBP1的表达影响中华蜜蜂工蜂幼虫肠道重量并参与幼虫肠道发育。     

中华蜜蜂6日龄幼虫响应蜜蜂球囊菌侵染的长链非编码RNA应答研究

[目的] 本研究旨在探究长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）在中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）6日龄幼虫应答蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis,简称球囊菌）侵染过程中的差异表达谱及调控作用。[方法] 利用链特异性cDNA建库的RNA-seq技术对未被侵染及球囊菌侵染的中蜂6日龄幼虫肠道（AcCK和AcT）进行深度测序。通过相关生物信息学软件分析lncRNA的结构特征和表达谱。筛选并分析差异表达lncRNA（differentially expressed lncRNA,DElncRNA）的顺式（cis）作用及竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）调控网络。采用RT-qPCR验证测序数据及DElncRNA差异变化趋势的可靠性。[结果] AcCK和AcT共预测出642个已知lncRNA和487个新lncRNA。与蛋白编码基因相比,上述中蜂lncRNA外显子数更少、长度更短且表达量更低。43个antisense lncRNA与40个正义链mRNA之间互补配对。AcCK和AcT比较组包含367个上调lncRNA和268个下调lncRNA。有194个DElncRNA潜在调控461个上下游基因,并涉及细胞进程、代谢进程和催化活性等38个功能条目以及氨基酸代谢、内吞作用和MAPK等191条通路。此外,有180个DElncRNA可靶向结合50个DEmiRNA,进而调控6365个mRNA;三者之间形成较为复杂的ceRNA调控网络。[结论] 中蜂6日龄幼虫肠道的部分lncRNA可作为antisense lncRNA参与应答球囊菌侵染;部分DElncRNA可通过cis作用调节物质代谢和免疫途径相关的上下游基因,从而介导宿主的侵染应答;TCONS_00010661和TCONS_00003104等DElncRNA可通过ceRNA网络调控Jak-STAT和氧化磷酸化等通路及富集基因,进而参与宿主的侵染应答。     

基于PacBio测序数据的蜜蜂球囊菌SNP与InDel位点发掘及分析

[目的]本研究拟利用已获得的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis菌丝的PacBio单分子实时(single molecule real-time,SMRT)测序数据对蜜蜂球囊菌的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)和插入缺失(insertion-deletion,...     

中华蜜蜂细胞色素P450基因及其全长转录本的鉴定及分析

【目的】利用纳米孔(nanopore)测序技术鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道中细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)基因及其全长转录本,为后续功能研究提供参考信息和基础。【方法】通过Nanopore PromethION平台对中华蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道进行转录组测序。利用Guppy软件对原始读段(raw reads)进行质控以得到有效读段(clean reads)。通过识别两端引物鉴定全长转录本序列。使用BLAST工具将上述全长转录本的序列比对到Nr和GO数据库以鉴定CYP450基因及其全长转录本。采用Astalavista软件鉴定基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件。通过RT PCR验证不同类型AS事件的可靠性。【结果】在中华蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中分别测得7 338 627, 7 003 419和7 434 233条原始读段,经质控得到的有效读段数分别为7 289 494, 6 959 880和7 387 756条。鉴定到的非冗余全长转录本总数为48 200条。共鉴定到47个CYP450基因和265条CYP450基因全长转录本。共鉴定到CYP450基因的90次AS事件,包括36次外显子跳跃事件、20次可变5′端剪接位点事件、17次内含子保留事件、9次可变3′端剪接位点事件及8次外显子互斥事件。RT PCR结果证实随机选取的3种AS事件类型真实可靠。【结论】鉴定了中华蜜蜂的CYP450基因及其全长转录本,补充了东方蜜蜂参考基因组的相关注释,并揭示中华蜜蜂CYP450基因可通过多种AS类型产生丰富的剪接体。     

意大利蜜蜂工蜂中肠SNP和InDel突变位点的挖掘及分析

本研究利用已获得的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠的转录组数据对意蜂的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）和插入缺失（Insertion-Deletion, InDel）突变位点进行挖掘和分析,共鉴定到232 678个SNP位点,其中发生转换和颠换的SNP位点数分别为196 087和36 591个;最丰富的突变类型是G/A,最少的突变类型为T/G;分布在内含子的SNP位点最多,其次为外显子和基因间区;密码子突变类型为同义突变的SNP位点数最多,其次是非同义突变、终止子增加和终止子减少;此外,SNP位点所在基因可注释到 50个 GO条目和351条KEGG通路。共鉴定到38 715个InDel位点,最丰富的突变类型为移码插入,其次是移码缺失;分布InDel位点数较多的基因组区域为内含子和基因间区;另外,InDel位点所在基因可注释到50个功能条目和340条通路。研究结果丰富了西方蜜蜂Apis mellifera的SNP和InDel位点信息,并为开发和利用意蜂的新型分子标记提供基础。