富含RNA酶大鼠腺体组织总RNA提取方法改良

为了改良传统提取富含RNA酶大鼠胰腺和腮腺组织总RNA方法,本研究将组织样本分成对照组,0.5％,1.0％和2.0％β-巯基乙醇处理组,对照组采用Trizol法提取总RNA,β-巯基乙醇处理组分别于Trizol试剂中加入0.5％,1％,2％β-巯基乙醇.测定不同处理组单链核酸含量、完整性,A260/280和A260/230;采用实时荧光定量PCR检测管家基因β-actin,GAPDH,胰腺淀粉酶AMY2和腮腺水通道蛋白AQP-5表达情况,并通过计算扩增效率,验证β-巯基乙醇是否对后续PCR实验有影响.结果表明,不同处理组单链核酸含量、A260/280,A260/230无显著差异,β-巯基乙醇组RNA完整性显著高于对照组,1.0％,2.0％β-巯基乙醇组RNA完整性显著高于0.5％β-巯基乙醇组,1.0％β-巯基乙醇组RNA完整性与2.0％β-巯基乙醇组无显著差异;添加1.0％β-巯基乙醇对后续PCR试验无影响.综上所述,在传统Trizol法内添加β-巯基乙醇可显著提高胰腺和腮腺组织总RNA提取质量,其中添加1.0％β-巯基乙醇是最佳提取方案.     

不同固定液对体外细胞系荧光蛋白淬灭及对胞内蛋白荧光染色的影响

目的:比较不同细胞固定液对荧光蛋白淬灭情况以及核内、胞浆蛋白免疫荧光染色的影响。方法:分别对融合了RFP和GFP基因的鼻咽癌HK1细胞采用95%乙醇、75%乙醇、甲醇、丙酮:甲醇=1:1、5%冰乙酸、Carnoy固定液进行固定,然后采用免疫荧光法对细胞进行免疫染色。结果:六种固定液均能使荧光蛋白猝灭。免疫荧光染色方面,对于核蛋白染色,75%乙醇、95%乙醇、丙酮:甲醇=1:1、Carnoy固定液固定后核区获得明显的荧光染色,而采用甲醇、5%冰乙酸固定后荧光染色不明显。对于胞质蛋白染色,按荧光染色的清晰程度分为固定于Carnoy固定液丙酮:甲醇=1:1甲醇5%冰乙酸75%乙醇95%乙醇,前四者固定可见分布于胞质,75%乙醇或95%乙醇固定的目标蛋白定位不清。结论:六种不同的固定液在有效失活荧光蛋白的情况下对核蛋白及胞浆蛋白抗原性的影响略有不同,可根据研究目的蛋白表达的部位及特点来选用合适的固定液。     

富含RNA酶大鼠腺体组织总RNA提取方法改良

为了改良传统提取富含RNA酶大鼠胰腺和腮腺组织总RNA方法,本研究将组织样本分成对照组,0.5％,1.0％和2.0％β-巯基乙醇处理组,对照组采用Trizol法提取总RNA,β-巯基乙醇处理组分别于Trizol试剂中加入0.5％,1％,2％β-巯基乙醇.测定不同处理组单链核酸含量、完整性,A260/280和A260/230;采用实时荧光定量PCR检测管家基因β-actin,GAPDH,胰腺淀粉酶AMY2和腮腺水通道蛋白AQP-5表达情况,并通过计算扩增效率,验证β-巯基乙醇是否对后续PCR实验有影响.结果表明,不同处理组单链核酸含量、A260/280,A260/230无显著差异,β-巯基乙醇组RNA完整性显著高于对照组,1.0％,2.0％β-巯基乙醇组RNA完整性显著高于0.5％β-巯基乙醇组,1.0％β-巯基乙醇组RNA完整性与2.0％β-巯基乙醇组无显著差异;添加1.0％β-巯基乙醇对后续PCR试验无影响.综上所述,在传统Trizol法内添加β-巯基乙醇可显著提高胰腺和腮腺组织总RNA提取质量,其中添加1.0％β-巯基乙醇是最佳提取方案.     

富含RNA酶大鼠腺体组织总RNA提取方法改良

为了改良传统提取富含RNA酶大鼠胰腺和腮腺组织总RNA方法,本研究将组织样本分成对照组,0.5％,1.0％和2.0％β-巯基乙醇处理组,对照组采用Trizol法提取总RNA,β-巯基乙醇处理组分别于Trizol试剂中加入0.5％,1％,2％β-巯基乙醇.测定不同处理组单链核酸含量、完整性,A260/280和A260/230;采用实时荧光定量PCR检测管家基因β-actin,GAPDH,胰腺淀粉酶AMY2和腮腺水通道蛋白AQP-5表达情况,并通过计算扩增效率,验证β-巯基乙醇是否对后续PCR实验有影响.结果表明,不同处理组单链核酸含量、A260/280,A260/230无显著差异,β-巯基乙醇组RNA完整性显著高于对照组,1.0％,2.0％β-巯基乙醇组RNA完整性显著高于0.5％β-巯基乙醇组,1.0％β-巯基乙醇组RNA完整性与2.0％β-巯基乙醇组无显著差异;添加1.0％β-巯基乙醇对后续PCR试验无影响.综上所述,在传统Trizol法内添加β-巯基乙醇可显著提高胰腺和腮腺组织总RNA提取质量,其中添加1.0％β-巯基乙醇是最佳提取方案.