螺旋链霉菌遗传操作系统-接合转移体系的建立

背景:螺旋链霉菌(Streptomyces spiramyceticus)为国内螺旋霉素(spiramycin,SPM)的生产菌,但目前工业生产中螺旋链霉菌利用遗传操作进行基因改造还没有成功报道。目的:建立螺旋链霉菌遗传操作系统,利用遗传改造的方法改变SPM的组分比例,降低SPM的分离成本。方法:以大肠杆菌(Escherichia coli ET12567/pUZ8002)为供体,螺旋链霉菌为受体进行接合转移实验,建立螺旋链霉菌接合转移的遗传操作系统,并对影响接合转移效率的培养基种类、抗生素覆盖时间、供受体比例等条件进行优化。结果:螺旋链霉菌不适合利用孢子进行接合转移,利用菌体进行接合转移时ISP4培养基为接合转移的最适培养基,供受体比例为103∶1得到的接合子数量最多,接合转移效率为1.93×10-4,SPM中三种组分百分含量变化显著。结论:实验首次建立了螺旋链霉菌接合转移的方法,利用菌体进行接合转移操作,简化了实验操作过程,并且利用CRISRP/Cas9基因编辑系统成功阻断3-O-酰基转移酶基因,并在该位置导入φC31整合位点att B,为后续螺旋链霉菌的基因改造奠定了基础。     

基于代谢流量分布信息理解大肠杆菌中异柠檬酸裂解酶调节因子的代谢调控作用

基因的表达受不同的转录调节因子调节。大肠杆菌中的异柠檬酸裂解酶调节因子(IclR)能够抑制编码乙醛酸支路酶的aceBAK操纵子的表达。本研究基于代谢物的13C同位体物质分布来定量解析代谢反应,主要研究了iclR基因在大肠杆菌生理和代谢中的作用。大肠杆菌iclR基因缺失突变株的生长速率、糖耗速率和乙酸的产量相对于原始菌株都有所降低,但菌体得率略有增加。通过代谢途径的流量比率分析发现基因缺失株的乙醛酸支路得到了激活,33%的异柠檬酸流经了乙醛酸支路;戊糖磷酸途径的流量变小,使得CO2的生成量减少。同时,乙醛酸支路激活,但草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸的流量基本不变,说明磷酸烯醇式丙酮酸-乙醛酸循环没有激活,没有过多的碳原子在磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶反应中以CO2形式排出,从而确保了菌体得率。葡萄糖利用速率的降低、乙酰辅酶A的代谢效率提高等使得iclR基因敲除菌的乙酸分泌较原始菌株有所降低。     

基于Matlab对解脂耶氏酵母基因组规模代谢网络模型仿真结果的可视化分析

【目的】近十年来,基因组代谢网络模型迅速发展。通过构建基因组代谢网络模型进行计算机仿真模拟已成为研究生物体复杂的生理代谢不可或缺的工具。实现对仿真结果的可视化分析,可以直观地追踪模型中的代谢流向,从而更好地对仿真结果进行分析。【方法】在简要概述目前可视化方法的基础上,提出了一种基于Matlab实现基因组规模代谢网络模型仿真结果可视化的方法：通过CellDesigner预先绘制与模型相匹配的图,通过RAVEN toolbox中的函数于Matlab进行读图、并实现仿真结果的可视化。【结果】以解脂耶氏酵母基因组规模代谢网络模型iYL619_PCP v1.7为对象,实现并阐明其仿真结果的可视化。【结论】通过该方法可以清晰地监测模型中的流量和流向变化,提高仿真结果的分析效率。     

药用植物萜类化合物的生物合成与代谢调控研究进展

药用植物来源的萜类化合物是自然界中广泛存在的次级代谢产物,其结构与功能多样,具有抗癌、抗氧化、抗病毒等广泛的药理作用.本文以青蒿素、丹参酮、人参皂苷为例,总结了其代谢途径关键酶基因、转录调控、代谢工程、合成生物学、合成与转运等研究进展,并对今后的发展方向进行展望.     

CRISPR/Cas9编辑大肠杆菌工程菌生产氨基葡萄糖

【背景】氨基葡萄糖(glucosamine, GlcN)及其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)是合成糖胺聚糖的重要前体物质,在医药、化妆品和保健品领域具有广泛的应用价值。传统的生产方式存在诸多弊端,如环境污染、原料限制、不适于海鲜易过敏人群等问题,因此利用微生物发酵法生产GlcN和GlcNAc越来越受到青睐。【目的】利用微生物发酵生产并提高N-乙酰氨基葡萄糖的产量,探索分子改造及发酵条件优化策略。【方法】以大肠杆菌MG1655为出发菌株,首先利用表达载体共表达大肠杆菌来源的glmS和酿酒酵母来源的gna1,构建GlcNAc的生物合成路径,然后利用CRISPR/Cas9技术敲除GlcNAc的分解代谢与转运途径,以提高GlcNAc的产量,最后结合发酵条件优化使GlcNAc的产量得到进一步提升。【结果】通过分子改造得到一株产GlcNAc菌株RY-5,发酵20 h后GlcNAc的产量达到了2.36 g/L,相较于初始构建的菌株RY-1提高了29倍,进一步对装液量和诱导剂IPTG的添加时间等条件进行发酵优化,GlcNAc产量达到了7.74g/L,与优...     

由基质对优化链霉素发酵过程的分析

通过对链霉素发酵过程中历史最优水平及当前生产的基质补入与消耗数据的详细比较和分析,推出实际生产上补料操作中可能存在的问题,找到了基于实际情况的较优补料时间和补料量,并以此改进补料控制,使平均放罐效价比原先提高３０００ｕ／ｍｌ左右,获得较大的生产效益。     

适应性进化与甜菜碱的添加促进安丝菌素的生产

【背景】安丝菌素是一类由珍贵束丝放线菌橙色亚种(Actinosynnema pretiosum ssp. auranticu)生产的美登素类衍生抗生素,属于大环内酰胺类物质,根据不同的C-3位基团可以分为一系列衍生物。目前已上市的高效抗癌药物曲妥珠单抗(T-DM1)以AP-3 (Ansamitocin P-3)为生产底物,并表现出很好的乳腺癌治疗效果。然而当前AP-3的产量较低,其过高的成本限制了进一步发展。【目的】应用适应性进化及添加适量甜菜碱策略提高安丝菌素AP-3的产量。【方法】以珍贵束丝放线菌橙色亚种为出发菌株,链霉素和巴龙霉素为胁迫压力进行适应性进化,筛选出安丝菌素积累较高的菌株,随后向进化菌株的发酵培养基中添加0.1%的甜菜碱,AP-3的产量进一步提高,同时分析了进化菌株AP-3相关基因的转录水平,初步探索进化菌株安丝菌素积累提高的原因。【结果】得到2株进化菌株Str16-4-4和Par16-2-1,发酵7d后AP-3产量分别提高了33.4%和31.7%,添加甜菜碱后其AP-3产量相比出发菌株提高了54.6%和47.4%。【结论】通过适应性进化的策略获得了AP-3生产能力提高的珍贵束丝放线菌橙色亚种进化菌株,对促进AP-3的生产提供了新思路,而且为适应性进化策略提高目标产物的产量提供了新的例证。     

代谢流量比率分析及其在代谢工程中的应用

细胞内代谢反应流量在系统理解细胞代谢特性和指导代谢工程改造等方面都起着重要的作用。由于代谢流量难以直接测量得到,在很多情况下通过跟踪稳定同位素在代谢网络中的转移并进行相应的模型计算能有效地定量代谢流量。代谢流量比率分析法能够高度体现系统的生物化学真实性、辨别细胞代谢网络的拓扑结构,并且能够相对简单快速地定量反应速率等,因此受到代谢工程研究者越来越多的重视。以下着重介绍并讨论了利用代谢物同位体分布信息分析关键代谢节点合成途径的流量比率、基于流量比率的代谢流量解析、以及应用于代谢工程等的相关原理、实验测量、数据分析、使用条件等,以期充分发挥代谢流量比率分析法的优势,并将其拓展推广至更多细胞体系的代谢特性阐明和代谢工程改造中去。