热稳定性伯克霍尔德菌脂肪酶A突变体的筛选

摘要:【目的】为更好地提高伯克霍尔德菌ZYB002脂肪酶LipA在TMP纸浆造纸工艺中的应用,有必要利用蛋白质工程技术,提高其热稳定性。【方法】基于B-factor值筛选LipA多肽链中潜在的突变位点,利用迭代饱和诱变技术,构建突变文库,筛选热稳定性提高的突变体。【结果】利用上述方法,从4个突变文库中分别筛选到在55℃下,半衰期较野生型脂肪酶LipA分别提高了1.8倍、3倍、2.2倍和1.7倍的脂肪酶突变体。【结论】基于B-factor值选择突变位点,利用迭代饱和突变技术,快速筛选到热稳定性有显著提高的突变体。     

伯克霍尔德氏菌ZYB002脂肪酶lipC24基因的克隆、表达及其酶学性质

【目的】克隆伯克霍尔德菌ZYB002菌株中的新型脂肪酶lip C24基因,测定其基本酶学性质,为后续深入研究该基因在菌株中的生理功能奠定基础。【方法】根据洋葱伯克霍尔德菌JK321菌株的全基因组DNA信息,直接设计引物从伯克霍尔德菌ZYB002菌株基因组中扩增出lip C24基因,并对之进行原核表达、重组蛋白的纯化及酶学性质分析。【结果】lip C24基因全长1317 bp,编码438个氨基酸残基;多肽链中具有保守五肽-G-X1-S-X2-G-序列;重组蛋白Lip C24的分子量为45 k Da;能有效水解各种对硝基苯酯,对中链脂肪酸的对硝基苯酯表现出偏爱性;其催化水解反应的最适温度为40℃,最适p H7.5;40℃下的半衰期为15.72 min,在p H 7.0-8.0的条件下,具有较好的稳定性。【结论】lip C24的编码产物为一个45 k Da蛋白,具有明显的脂肪酶活性,为中温中性脂肪酶。     

微生物脂肪酶蛋白质工程*

微生物脂肪酶催化的化学反应具有严格的立体选择性、位点选择性等专一性,催化活性高而副反应少,催化反应不需要辅助因子等特点,因此广泛应用于工农业生产中的诸多领域。利用蛋白质工程技术,提高微生物脂肪酶的特异性、活性和稳定性,对提高微生物脂肪酶制剂产品的市场竞争能力,扩大微生物脂肪酶的应用领域,具有重要的意义。综述了蛋白质工程技术在微生物脂肪酶改性方面的应用现状、存在问题及前景。     

长梗木霉内切葡聚糖酶I基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

一株纤维素酶高产菌株经ITS序列鉴定并命名为长梗木霉SSL (Trichoderma longibrachiatum, SSL)。利用RT-PCR的方法从该菌株中克隆出内切-1-4-β-D-葡聚糖酶I的基因 (eg1), 该基因全长1386 bp, 编码461个氨基酸。序列分析表明：该基因序列与T. longibrachiatum egl1基因具有90％以上的同源性。将该基因的成熟肽编码序列插入到Pichia pastoris表达载体ppic9k中, 构建重组表达质粒ppic9k-eg1, 转化P. pa     

耐有机溶剂极端微生物的耐受机制及应用

耐有机溶剂微生物是一类新颖的极端微生物,直到20世纪80年代才被系统地研究.它们通过各种耐受机制,有效抵御或降低有机溶剂对其细胞产生的毒害作用.因此,在全细胞催化、环境污染治理等领域,耐有机溶剂极端微生物具有广阔的工业应用前景.此外,深入透彻地了解耐有机溶剂极端微生物的各种耐受机制,有助于利用基因工程技术改造和优化现有耐有机溶剂极端微生物的各种性能,进一步拓展其工业应用领域.本文将从囊泡外排、改变细胞膜磷脂结构和组成等4个方面概述近年来耐有机溶剂极端微生物的耐受机制研究新进展,并介绍它们在全细胞催化等领域的应用.     

Burkholderia sp.ZYB002中lipA基因的敲除对细胞脂肪酶活性的影响

Burkholderia sp.ZYB002菌株不仅能产生大量的胞外脂肪酶,还能产生大量的细胞结合脂肪酶。对细胞结合脂肪酶的种类进行定性研究,将为开发全细胞脂肪酶催化剂奠定基础。通过分析与Burkholderia sp.ZYB002菌株具有较高同源性的Burkholderia cepacia J2315菌株的脂肪酶基因家族,推测潜在的细胞结合脂肪酶编码基因。通过同源重组插入失活Burkholderia sp.ZYB002菌株的lipA基因,筛选出突变体转化子;测定突变体菌株细胞结合脂肪酶的活性,并与野生型菌株比较。试验结果表明,lipA基因插入失活的Burkholderia sp.ZYB002-ΔlipA菌株的细胞结合脂肪酶活性降低了42%。     

理性设计盐桥构建伯克霍尔德菌脂肪酶热稳定突变体

【目的】借助蛋白质工程技术提高伯克霍尔德菌ZYB002脂肪酶LipA的热稳定性,以期更好地将其应用于工业生产中。【方法】利用YASARA、Fold X、Rosetta、Gromacs等生物信息学软件,构建1个脂肪酶Lip A的热稳定性提高的微型突变体电子文库;通过对突变体的结构信息和自由能变化进行评估,筛选出潜在的有价值的突变体。继而利用基因定点突变技术,构建上述候选突变体的突变基因文库,通过实验筛选出热稳定性提高的脂肪酶LipA突变体。【结果】利用上述方法,从构建的20个脂肪酶LipA突变体中,筛选到热稳定性有显著提高的3个突变体LipA-Asn~(125)Asp、LipA-Asn~(125)Glu和LipA-Gln~(262)Glu。经55°C处理12 min后,上述3个突变体的T1250值较野生型分别提高4.0°C、5.5°C和4.4°C;在55°C下的半衰期较野生型分别提高了2.2倍、3.8倍和2.6倍。【结论】利用生物信息学软件,构建脂肪酶LipA突变体电子文库,结合蛋白质的结构信息,可以快速筛选到热稳定性提高的脂肪酶LipA突变体。     

海洋破囊壶菌Thraustochytrium sp. FJN-10 DHA生物合成 途径相关延长酶的克隆与表达

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是具有各种重要生理功能的高度不饱和脂肪酸.以海洋真菌Thraustochytrium sp.FJN-10为研究对象,利用RT-PCR结合RACE,获得了两个碳链延长酶(TFD6和TFD5)的完整基因,其中TFD6 cDNA全长816 bp,编码271个氨基酸;TFD5 cDNA全长831 bp,编码276个氨基酸.将TFD6、TFD5酶切后分别连接到HindⅢ/Xba Ⅰ处理过的pYES2载体,醋酸锂法转化酿酒酵母感受态细胞,成功构建了延长酶酵母表达系统.气相色谱分析表明TFD6可延长C18:3n-6至C20:3n-6,TFD5可延长C20:5n-3至C22:5n-3.