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目的:基于由环状异构黄色荧光蛋白(Circularly Permuted EYFP)改造的具有线粒体定位功能的Ratiometric-pericam-mt(rp-mt)荧光蛋白构建携带有rp-mt基因的慢病毒载体,验证其在线粒体钙检测中的功能,为进一步研究线粒体钙稳态在细胞生命活动中发挥的作用提供参考依据。方法:采用慢病毒载体EF-1αF-puro和rp-mt质粒构建携带有rp-mt基因的重组慢病毒载体,经脂质体法在293T细胞中与包装质粒共转染,收集构建好的重组慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt并体外感染人肝癌细胞SNU-739,验证重组慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt的活性功能。结果:以慢病毒载体EF-1αF-puro为骨架质粒,成功构建了携带有rp-mt基因的重组慢病毒载体(EF-1αF-puro-rp-mt),收集获得的重组慢病毒滴度为4×10~6TU/m L。将携带有rp-mt基因的慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt感染SNU-739细胞48小时后,在荧光显微镜下观察到有超过85%的细胞发出绿色荧光,定位于细胞线粒体内,且对SNU-739细胞进行Ru360和CGP37157处理后,细胞荧光强度随线粒体内钙水平改变而增强或减弱。结论:采用脂质体包装法成功构建了携带有rp-mt基因的重组慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt,细胞经该慢病毒转染后可稳定表达具有线粒体定位功能的荧光蛋白rp-mt,准确地检测细胞线粒体钙离子水平。 相似文献
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