一种新型亮氨酸5-羟化酶NmLEH的异源表达、纯化及酶学性质分析 *

羟基化氨基酸是一种新型氨基酸衍生物,可广泛用作化工材料的前体物及医药合成的中间体。将来源于Nostoc minutum的新型L-亮氨酸5-羟化酶 (NmLEH) 通过重组质粒在大肠杆菌中异源表达。结果表明,在BL21(DE3) 宿主细胞中,诱导温度为25℃,IPTG诱导浓度为0.5mmol/L,诱导10h时,蛋白质表达量最高 (0.45mg/ml);通过Ni-亲和层析和凝胶过滤层析两步分离纯化获得了高度纯化的重组NmLEH蛋白;对NmLEH的酶学性质进行了表征,该酶的最适反应温度为25℃,最适pH 为7.5,在pH 7.0~9.0较为稳定,最适底物为亮氨酸和甲硫氨酸;同源序列分析表明NmLEH属于亚铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族[Fe(II)/αKG-Dos],并预测了该酶的保守催化活性位点(H150、D152、H236);通过同源建模得到了该蛋白质的模拟结构,分析了该蛋白质催化活性中心的形成机制。     

细胞色素P450酶的结构、功能与应用研究进展

细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP)酶是广泛存在于微生物、动植物及人体中与膜结合的血红蛋白类酶,具有氧化、环氧化、羟化、去甲基化等多种生物催化活性。CYP酶在药物、类固醇、脂溶性维生素和许多其他类型化学物质的代谢中具有重要作用,其在异源物质的解毒、药物相互作用和内分泌功能等领域的研究是热点问题。本综述对CYP的结构、功能、临床应用与开发前景进行了概述,并对其最新的研究现状和发展前景进行探讨。     

疏水性氨基酸的羟基化研究进展

羟基化氨基酸在生物技术和分子生物学中具有独特价值,具有抗真菌、抗菌、抗病毒和抗癌的特性。通过比较化学合成与生物催化合成羟基氨基酸的异同,选择具有高对映结构选择性的生物催化合成方法成为羟基氨基酸合成的首选。生物催化实现疏水性氨基酸的羟基化和羟化酶紧密相关,而羟化酶又是单核非血红素Fe(Ⅱ)和α-酮戊二酸依赖型双加氧酶(Fe/αKGDs)的一种,Fe/αKGDs存在共性催化机制。因此,疏水性氨基酸在被催化的过程中,会利用关键中间体高价铁-超氧复合体(Fe(Ⅳ)=O)引起多种氧化转化,从而完成羟基化过程。文中就疏水性氨基酸的羟基化合成及功能应用,尤其是(2S,3R,4S)-4-羟基-异亮氨酸(4-HIL)和羟脯氨酸,进行了详细的阐述,探讨了Fe/αKGDs的共性催化反应机制,并对羟基氨基酸在基础研究和工业中的应用进行了综述。     

胆固醇7,8位脱氢酶的表达及催化活性研究

果蝇的neverland基因是胆固醇7,8位脱氢的重要酶基因。为了探究其在胆固醇脱氢反应中的催化机制,将neverland分别克隆至表达载体p IEx-6及p XY212,再转染导入S2细胞并电转化到S.cerevisiae W303-1A中表达。Western blot结果证实NVD蛋白在重组S2细胞及S.cerevisiae W303-1A中实现了表达。胆固醇转化实验经HPLC分析发现,重组S2细胞可以将胆固醇转化为7-脱氢胆固醇,而重组S.cerevisiae W303-1A并不能实现胆固醇的7,8位脱氢。此外,在重组S.cerevisiae W303-1A和S2细胞的破碎液共同转化胆固醇及NVD体外转化实验中也未发现产物7-脱氢胆固醇的生成。实验结果显示,neverland基因在S2细胞中具有生物活性而在S.cerevisiae中没有生物活性,表明它在胆固醇脱氢时需要其它的伴侣蛋白协助,实验结果为进一步研究其催化机制提供了理论基础。     

一株高效氧化胆固醇的简单节杆菌构建与转化条件优化

为实现胆固醇的高效生物氧化,利用基因工程手段将编码简单节杆菌胆固醇氧化酶的DNA片段克隆到质粒pTY2中,构建pTY2-5332插入表达载体。该载体以简单节杆菌基因组中的16S rDNA位点为整合点,提高了胆固醇氧化酶在基因组中的拷贝数,实现了简单节杆菌胆固醇氧化酶的过表达。重组菌的生长实验分析表明,插入到16S rDNA位点的胆固醇氧化酶没有影响简单节杆菌的生长。重组菌可在20h将2g/L的胆固醇完全转化为4-胆甾烯-3酮,比原始菌的转化时间缩短了4h,提高了胆固醇的转化效率。经过转化条件优化确定了该重组菌以2%的接种量后继续培养16h,然后胆固醇经120目过筛后投料量为2g/L,并添加2%（体积比）二甲基甲酰胺作为促溶剂;胆固醇添加18h后可完全转化为4-胆甾烯-3-酮,是优化前的1.11倍。     

谷氨酸棒杆菌基因编辑的研究进展

谷氨酸棒杆菌是生产氨基酸、有机酸等的重要菌株,广泛应用于食品、医药领域。利用基因编辑技术对谷氨酸棒杆菌进行基因功能研究,在提高目的产物产量、发现新的基因功能等方面有重要意义。近年来,基因编辑技术发展日新月异,从基于同源重组的传统基因编辑技术到以人工核酸酶介导的基因编辑均在谷氨酸棒杆菌中得到合理应用。其中,CRISPR技术以其快速、简便、编辑效率高等优点成为现阶段研究者用于改造谷氨酸棒杆菌的主要技术,但是更为简单、高效的编辑手段依旧需要进一步研究开发,以获得优良菌株应用于工业生产中。     

胆固醇氧化酶PsCO_4异源表达、纯化及酶学性质分析

胆固醇氧化酶专一性催化胆固醇为胆甾-4-烯-3-酮,广泛的应用于临床以及食品加工行业。本论文将来源于Pimelobacter simplex的胆固醇氧化酶PsCO_4,分别转化到大肠杆菌宿主BL21(DE3)、Rosetta(DE3)和C41(DE3)中,在不同温度(15℃、25℃、37℃)及IPTG诱导浓度(0.01mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L)下异源表达Ps CO_4。结果表明,转入Rosetta(DE3)菌株的PsCO_4蛋白,在IPTG浓度为0.1mmol/L、15℃下经18h诱导表达,PsCO_4可溶性表达量最高(0.63mg/ml)。异源表达的胆固醇氧化酶PsCO_4最适温度为30℃,最适pH为7.5。通过TLC,GC-MS检测出Ps CO_4催化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮。以胆固醇和β-谷甾醇、豆甾醇和孕烯醇酮为底物,测定PsCO_4对四种底物的催化反应动力学参数,胆固醇k_(cat)/K_m为0.08s~(-1)·μM~(-1)分别高于β-谷甾醇(0.04s~(-1)·μM~(-1))、豆甾醇(0.005s~(-1)·μM~(-1))和孕烯醇酮(0.02s~(-1)·μM~(-1))。     

来源于红球菌胆固醇氧化酶ChOG的异源表达、纯化及催化反应结构分析

胆固醇氧化酶是胆固醇代谢过程中的关键酶,临床上用胆固醇氧化酶作为检测血清胆固醇含量的应用潜力巨大。将来源于红球菌Rhodococcus ruber的胆固醇氧化酶Ch OG,分别转化到大肠杆菌宿主BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中,在不同条件下进行诱导表达,结果表明:BL21(DE3)菌株在诱导温度为16℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L时,Ch OG可溶性表达量最高(0.49 mg/ml)。Ch OG的最适反应温度为30℃,最适反应p H为7.5。最适反应条件下,酶活性达到8.0 U/mg。利用TLC、HPLC对Ch OG催化产物胆甾-4-烯-3-酮进行了鉴定分析。三维结构及定点突变分析表明Glu406及Arg408、Glu261在进行胆固醇C3羟基的脱氢、质子传递,以及底物异构化方面发挥着重要作用。     

酶法生产稀少糖的研究进展

稀少糖是指自然界中存在稀少的单糖及其衍生物,可应用于食品、制药和营养等许多领域,同时也可以作为各种天然产品和候选药物的原料。目前大多数稀少糖因其在自然界中含量稀少而非常昂贵,而且这些稀少糖的化学合成原料价格高昂,不利于其大量生产。由于酶催化反应具有反应条件温和、特异性强、效率高、可持续性强等优点,稀少糖酶法生物合成已成为这一领域的有力工具。文中就稀少糖,包括D-阿洛酮糖、D-塔格糖、D-山梨糖、L-果糖、D-阿洛糖等其他稀少糖的生物学功能及应用,以及稀少糖相关酶的研究和酶法生产进行综述。